不同梯度NaCl胁迫对甜高粱幼苗抗氧化同工酶亚基及酶活性的影响

赵会君++李欢++刘海波

摘要： 以甜高粱品种M-81E为材料，采用水培的方法，研究盐浓度为0、25、50、100mmol/L的胁迫处理对甜高粱幼苗抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）]同工酶亚基、酶活性以及叶片中丙二醛含量的影响。结果表明：不同浓度的盐胁迫对甜高粱幼苗叶片中SOD、POD、CAT、APX活性的影响程度不同，SOD活性随着盐胁迫时间的延长和浓度的增大在一定范围内降低，而POD、CAT、APX活性却在一定范围内显著升高，表现为同工酶亚基条带增多或者亮度增强。甜高粱幼苗叶片丙二醛含量随着胁迫时间的延长有上升趋势，但不显著。由研究结果可知，盐胁迫对甜高粱的抗氧化酶系统进行了修饰，导致SOD活性下降，因此SOD并没有起到清除过氧化物的作用，而CAT、APX和POD在甜高粱耐受盐碱胁迫中起到重要的保护作用。

关键词： 甜高粱；盐胁迫；同工酶；抗氧化酶系統；丙二醛

中图分类号： Q554；S514.01 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）22-0089-05

宁夏地处西北内陆，有大面积待开发的盐碱化土地，仅银川北部的盐碱化土地面积已经达到总耕地面积的49%，这已经成为宁夏农业生产的重要影响因素之一[1]。因此，筛选适合盐碱地种植的作物，充分开发利用盐碱地，对于当地的经济发展和农业生产有着重要的意义。甜高粱别称糖高粱、芦粟、甜秆等，是禾本科高粱属一年生草本植物，为普通粒用高粱的变种，具有抗旱、耐涝、耐盐碱、适应性强、生物产量高、糖分含量高等特点，对土壤的适应能力很强，是名副其实的高效能植物[2-3]。再吐尼古丽·库尔班等对甜高粱改良盐碱地的效果进行研究，结果表明，种植甜高粱后对盐碱地有非常明显的脱盐效果，种植过程中土壤盐分含量逐渐降低，土壤养分含量也发生明显的变化，其中pH值轻度降低[4]。随着我国出台的《中国可再生能源中长期发展规划》的推行，大力发展盐碱地甜高粱等非粮生物质能源作物的种植，对盐碱化土地的有效利用以及能源危机的缓解有重大意义。

当遭受盐碱胁迫时，植物体内会累积较多的活性氧，若不能及时清除就会使膜系统受到损伤，对植物体造成不同程度的伤害甚至死亡。龚明等对盐胁迫下大麦、小麦等叶片脂质过氧化伤害与超微结构的变化研究发现，盐分可以增加膜的透性，增强脂质过氧化作用，最终导致膜系统破坏[5]。盐生植物或耐盐植物在盐碱胁迫下膜系统的变化过程是先被破坏，然后被修复。植物能否维持其膜系统的完整性，关键在于其修复能力大小，而膜系统的修复与 超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性高低是分不开的。SOD、POD、CAT及APX是植物体内的抗氧化酶系统，它们相互协调、共同作用来清除膜脂过氧化作用产生的活性氧和丙二醛，最终达到保护膜结构的作用[6]，抗氧化系统的协调作用使活性氧簇（ROS）在体内维持较低水平，从而使植物能进行正常生长和发育。

因此，本试验以甜高粱品种M-81E为材料，研究不同浓度的盐胁迫对抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性以及同工酶亚基、丙二醛（MDA）含量等生理指标的影响，以探讨甜高粱苗期耐盐的生理机制，对甜高粱的适地种植有重要的指导意义，也为开发利用盐碱地发展生物质能源提供品种资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试甜高粱品种为M-81E，由北方民族大学植物生理实验室提供，选取当年产的籽粒饱满、大小均匀的种子备用。

1.2 试验方法

1.2.1 幼苗培养及处理 种子用自来水反复冲洗后用10%次氯酸钠消毒10 min，常温下用灭菌水冲洗并浸泡8 h，摆放在铺有2层滤纸的培养皿中，置于27 ℃恒温生化培养箱内催芽。等芽长约为3.0 cm时，置于28 ℃光照培养箱内进行光照培养。待苗高约为5cm时，转至自然光条件下用Hoagland营养液培养，每周更换1次培养液。

待甜高粱幼苗长到3叶1心时，将幼苗随机分组，设置0、25、50、100 mmol/L 4个NaCl处理梯度，每个处理设3个重复，于处理后的第2天取叶片提取可溶性总蛋白，用于同工酶电泳检测，于处理后第3、6、12、18天称取成熟叶片0.5 g，用于测定SOD、POD、CAT、APX活性以及丙二醛含量（鲜质量）。

1.2.2 酶液的提取及同工酶电泳 取处理第2天的0.5 g新鲜成熟叶片，加入5 mL冰上预冷的50 mmol/L磷酸缓冲液（pH值7.0），于冰浴中研磨，4 ℃、12 000 g离心20 min，收集上清液，即为酶粗提液。可溶性总蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法。同工酶电泳采用北京市六一仪器厂生产的垂直板凝胶电泳仪，电泳时SOD、POD、CAT采用10%分离胶、5%浓缩胶，APX采用7.5%分离胶、5%浓缩胶，上样量35 μL，预电泳10 min，浓缩胶中稳定电压为80 V，进入分离胶后稳定电压为120 V，电流为200 mA。于冰浴中电泳3～4 h，当指示染料下行至距胶板末端1～2 cm时停止电泳。

SOD同工酶采用氮蓝四唑法染色[7]，POD同工酶采用醋酸-联苯胺法染色[8]，CAT采用淀粉法染色[9]，APX参照邵巍等的方法染色[10]。根据染色的酶谱计算相对迁移率Rf（Rf=酶带迁移距离/前沿指示剂距离）。

1.2.3 酶液的提取及酶活测定 分别取处理3、6、12、18 d的成熟叶片0.5 g，酶液提取方法及可溶性总蛋白含量测定方法同“1.2.2”节，SOD活性测定采用氮蓝四唑（NBT）法[11]，POD活性测定采用愈创木酚法[11]。CAT、APX活性的测定采用吴倩等的方法[12-13]。每个处理重复3次，所得数据用Graph Padprism 5.0统计软件分析。

2 结果与分析

2.1 胁迫早期过氧化物同工酶电泳结果

由图1的CAT同工酶染色检测结果看出，与对照相比，当受到盐胁迫时，CAT出现明显的2条带，并且亮度、酶带宽度明显增加，这暗示CAT同工酶基因受到盐胁迫的诱导，表达产物增加。与此同时，检测SOD的同工酶条带，结果表明，随着盐胁迫浓度的增加，SOD的S1亚基条带消失，S2、S3亚基条带亮度减弱，这暗示高浓度的盐胁迫抑制了SOD基因的表达。随着盐浓度的增加，在短时间内APX的A3条带亮度也逐渐增加，并且出现1条较为模糊的条带A2，这也显示相关基因受到盐胁迫诱导。POD染色结果显示，在短时间处理下，POD同工酶出现6条比较明显的条带，这6条带的亮度都随着胁迫浓度的增加而加深，尤其是P1、P2条带亮度和宽度增加比较明显，表明这2个亚基基因对NaCl胁迫更加敏感，能在短时间内受到盐胁迫的诱导。

2.2 不同处理浓度和时间下4种抗氧化酶的活性

2.2.1 不同處理浓度和时间下SOD活性的变化 SOD是重要的抗氧化酶，能够清除活性氧从而防止H2O2的生成，其活性的高低能反映植物耐受逆境环境的能力。在本试验中发现，胁迫初期，低浓度的盐胁迫在一定程度上能够刺激SOD活性增强，由图2可见，随着胁迫时间的延长和浓度的增大，SOD处于被抑制状态，尤其是第18天，对SOD的抑制达到显著水平（P<0.05），通过同工酶电泳试验也证实了这一结论，说明在高浓度的盐胁迫下，SOD并没有起到抗氧化保护作用，可能因为盐胁迫产生的过氧化产物为H2O2。

2.2.2 不同处理浓度和实践下POD的活性 POD是植物体内清除H2O2的重要抗氧化酶之一，也是植物受到伤害的重要指标。从图3可以看出，随着胁迫时间的延长，高浓度的盐胁迫都会使POD的酶活性显著升高，在处理第3天，100 mmol/L NaCl使POD活性极显著升高（P<0.01），而在处理第6天，25、50、100 mmol/L NaCl使POD活性极显著升高（P<0.01或P<0.001），说明POD活性的急剧上升，是甜高粱耐受盐碱胁迫的重要标志，POD也是参与清除过氧化物质的重要抗氧化酶之一。

2.2.3 不同处理浓度和时间下CAT的活性 由图4可见，与对照相比，当遭受盐碱胁迫后的第3天，CAT活性开始上升但变化不显著，随着处理时间的延长，CAT活性随盐浓度的升高不断上升，处理第6天发现，不同浓度NaCl使CAT活性与对照的差异达到了极显著水平（P<0.01），这一显著上升现象一直持续到处理的第18天。

2.2.4 不同处理浓度和时间下APX的活性变化 由图5可见，在50、100 mmol/L NaCl处理第3天，APX活性与对照相比 [CM（25]达到极显著差异（P<0.01、P<0.001）。 处理第18天，3个处理都使APX活性显著升高。由于APX具有清除H2O2的能力，APX活性的极显著升高说明盐碱胁迫导致甜高粱体内产生了较多的H2O2，提示APX对甜高粱的过氧化物清除起到重要作用。

2.3 不同处理浓度和天数下叶片中MDA含量

MDA是植物体内脂质过氧化的产物，其含量越高表明受氧化损伤的程度越大。图6结果显示，在胁迫第3天，25、50 mmol/L NaCl胁迫并没有使甜高粱体内的MDA含量上升，相反，100 mmol/L NaCl胁迫处理却使MDA含量极显著下降（P<0.01）；在处理的第6天、第12天，MDA含量都没有显著改变，在处理的第18天，100 mmol/L NaCl却使MDA含量显著上升（P<0.05）。分析其原因，可能是在胁迫早期，随着盐浓度升高，甜高粱体内抗氧化酶活性升高，从而使脂质过氧化程度降低，MDA含量也降低，当胁迫时间延长以及SOD被显著抑制，导致H2O2不能及时被清除，因此对细胞膜造成损伤，使MDA含量升高。

3 讨论

关于盐胁迫对植物的伤害机制的研究已有较多报道，主要表现在形态、生理生化指标的改变等方面[14]。孙方行等对刺槐进行3、17 d盐胁迫处理后发现，MDA含量和细胞膜透性存在极显著正相关关系，叶绿素浓度和可溶性蛋白含量也存在极显著相关关系，SOD活性和叶绿素浓度呈负相关[15]。吴成龙等对碱胁迫对菊芋幼苗生长及其光合作用、抗氧化作用的影响进行研究得出：在0.2%Na2CO3胁迫下，菊芋叶片SOD、POD和CAT活性均比正常生长条件下的增强[16]。植物耐受盐碱胁迫的主要过程就是减轻脂质过氧化作用和增强抗氧化物酶保护作用，SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质，有研究表明，植物的抗逆能力与SOD活性的高低有显著的相关性，而在本试验中发现，随着盐浓度的增加以及处理时间的延长，SOD同工酶亚基处于被抑制状态，活性下降，此结论与姜慧等关于盐胁迫对甜高粱幼苗抗氧化酶活性影响的研究结果[17]一致，表明在甜高粱耐受盐胁迫过程中SOD并没有起到主要的抗氧化保护作用，因此体内的H2O2物质可能是氧化损伤的主要物质之一。POD是植物体内活性较高的酶，一般在幼嫩的组织中活性较低，在老化的组织中活性较高，能够反映植物生长发育的特性、体内代谢状况以及对外界环境的适应性。在本试验中，POD酶亚基在胁迫早期电泳条带亮度就已经明显提高，可见其酶活性呈明显升高趋势，说明POD在甜高粱耐受盐胁迫的过程中起到抗氧化保护作用。CAT可促使H2O2分解为分子氧和水，起到清除体内的过氧化氢的作用，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害。在本试验中，由于CAT酶亚基胁迫早期条带数、亮度就增加，整个胁迫过程中酶活性都呈增加趋势，这使甜高粱体内的H2O2得到及时的清除，此试验结果与吴倩的研究结果[12]相似。APX是一种含铜的酶，能催化抗坏血酸（ASA）氧化，具有抗衰老等功能，在植物体内的物质代谢中起重要作用。POD、CAT、APX等酶活性的显著或极显著上升，对于清除这些过氧化物质起到重要的作用。因此可见，盐胁迫改变了甜高粱抗氧化酶系统的活性。