杂交鲟源恶臭假单胞菌的分离鉴定及药敏特性研究

杨圆圆，杨移斌，曹海鹏，方 伟，林汉群，杨先乐，艾晓辉

(1.广东省水生动物疫病预防控制中心，广东 广州 510222； 2.中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉 430223； 3.上海海洋大学，上海 201306)

杂交鲟源恶臭假单胞菌的分离鉴定及药敏特性研究

杨圆圆1，杨移斌2，*，曹海鹏3，方 伟1，林汉群1，杨先乐3，艾晓辉2

(1.广东省水生动物疫病预防控制中心，广东 广州 510222； 2.中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉 430223； 3.上海海洋大学，上海 201306)

对患肠炎病杂交鲟进行病原分离、鉴定及药敏试验，为杂交鲟肠炎病的防控提供参考。从患病杂交鲟肝、肾、脾及肠道中分离纯化病原菌，经理化特性测定及16S rRNA 序列分析对其进行鉴定，开展人工感染试验，并利用K-B法进行药敏特性分析。结果显示，分离到的XY4菌株是本次引发杂交鲟病害的致病菌，其对杂交鲟的LD50为1.30×106cfu·g-1。XY4菌株理化特性与恶臭假单胞菌一致，16S rRNA序列与恶臭假单胞菌同源性为100%，综合判定XY4菌株为恶臭假单胞菌。XY4菌株对头孢拉定、氟苯尼考及多西环素等9种抗生素高度敏感。养殖时可选用对恶臭假单胞菌敏感药物进行防控。

恶臭假单胞菌；杂交鲟(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂)；分离鉴定；药敏特性

1992年我国第一个鲟规模化养殖场在大连瓦房店成立，标志着我国鲟商业化养殖的开端，经过20多年的发展，鲟产业逐步形成了集种业、繁育、养殖及加工于一体的完整产业链，我国也成为世界第一大鲟养殖国。随着社会经济发展，人民生活水平不断提高，具备肉厚骨软、营养丰富、味道鲜美及品质高等优点的鲟产品受到消费者欢迎，市场需求不断增大，为此，我国不断扩大鲟养殖规模以满足市场需求。目前规模化养殖鲟种类主要有施氏鲟(Acipenserschrenckii)、西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)、杂交鲟(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂) 、匙吻鲟(Polyodonspathula)及俄罗斯鲟(Acipensergueldenstaedti)等[1]， 其中，杂交鲟因具有生长速度快、抗病能力强、怀卵量大等优势，是仅次于西伯利亚鲟及施氏鲟的第三大鲟养殖品种[2]。但近年来随着鲟养殖产量不断增大，养殖集约化及密度不断提高，鲟养殖环境越加恶劣，导致各种病害频发，严重影响了鲟养殖业的健康可持续发展[3]。目前已经报道的鲟致病菌主要有嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)[4]、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)[5]、豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)[6]、类志贺邻单胞菌(Plesimonasshigelloides)[7]、停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)[8]、海豚链球菌(Streptococcusiniae)[9]、产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)[10]、温和气单胞菌(Aeromonassobria)[11]、鲁氏耶尔森氏菌(Yersiniaruckeri)[12]、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)[13]、琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)[14]、分枝杆菌(Mycobacterium)[15]等。

2016年8—9月，广东河源某规模化养殖场养殖的杂交鲟陆续出现死亡，持续时间长达1个多月，发病死亡鱼体长在30～40 cm，发病水温在26～29 ℃，累计死亡约35%。本研究对发病鲟开展临床诊断、病原分离鉴定及人工感染等实验，从而确定病因，同时开展了病原敏感药物筛选，旨在为鲟细菌性病害防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鱼

10尾濒死杂交鲟采自广东河源某鲟规模化养殖场，体长在30～40 cm。感染用杂交鲟购于湖北清江某鲟规模化养殖场自繁苗，规格(30±1.5) g，体格健壮，无伤病，于实验室暂养7 d无异常后用于试验。

1.1.2 试验试剂

脑心浸液培养基(BHI)、脑心浸出液琼脂(BHIA)、水解酪蛋白琼脂(MH)、药敏纸片及细菌生化微量鉴定管均购自杭州微生物试剂有限公司；PCR反应体系、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；测序服务及引物合成均由武汉擎科创新生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 临床诊断

对杂交鲟养殖场环境进行调查，统计杂交鲟发病死亡率，确定病害主要危害对象规格；对发病濒死杂交鲟进行临床诊断，确定典型病症，并通过光学显微镜镜检确定有无寄生虫感染等，取具典型症状濒死杂交鲟回实验室作进一步分析。

1.2.2 病原菌分离

在无菌条件下，取患病濒死并具备典型症状的杂交鲟的肝、肾、脾及肠道划线于BHIA平板上，置于28 ℃恒温培养24 h后，挑取形态、大小及颜色基本一致的菌落进行细菌再纯化，获得的细菌纯培养物加入25%的甘油混匀后置于-80 ℃保存。分离菌株暂命名为XY4。

1.2.3 人工感染及LD50测定

人工感染： 将XY4菌株划线于BHI平板上，置于28 ℃恒温培养24 h，经无菌生理盐水洗下菌苔，并参照麦氏比浊法调整菌悬液浓度为8.4×109cfu·mL-1。

将感染用杂交鲟分成试验组及对照组，每组均设置3个重复，每个重复10尾杂交鲟。感染试验采取腹腔注射法，试验组每尾杂交鲟注射XY4菌株菌液0.1 mL，对照组相同部位注射等量无菌生理盐水。试验期间连续充氧，水温控制在(28±1)℃，每隔6 h观察杂交鲟游泳状态，及时记录发病死亡杂交鲟数量，同时对濒死杂交鲟进行解剖观察，并进行细菌再分离。

细菌半致死剂量(LD50)测定： 将XY4菌株菌液稀释成浓度为8.4×109、8.4×108、8.4×107、8.4×106、8.4×105cfu·mL-1的菌悬液，分别注射到不同组杂交鲟体内，每尾0.1 mL，即各组每尾注射剂量分别为8.4×108、8.4×107、8.4×106、8.4×105、8.4×104cfu，对照组注射等量无菌生理盐水，每组杂交鲟各30尾。持续观察杂交鲟的游泳状态，及时记录发病死亡数量，并用概率单位图解法[16]计算LD50。

1.2.4 形态学及生理生化特性测定

将XY4菌株接种于BHI平板上，置于28 ℃恒温培养24 h后，观察菌落大小、形态特征及其颜色，并进行革兰氏染色；采用细菌微量生化鉴定管参照《常见细菌系统鉴定手册》[17]测定分离菌株XY4的生理生化特性。

1.2.5 16S rRNA基因序列测定及系统发育分析

将菌株XY4接种于BHI培养基中，置于28 ℃振荡培养24 h，经高速离心后收集菌体，提取DNA作为PCR扩增反应模板。细菌16S rRNA序列扩增引物为：27F，5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。参照闫茂仓等[18]方法进行PCR反应扩增目的基因。扩增产物确定为目的片段后送武汉擎科生物公司纯化及序列测定。

将测序获得的16S rRNA基因序列在GenBank中进行Blast分析，根据比对结果下载同源性较高的16S rRNA序列，采用Clustal X软件进行多序列匹配分析，通过MEGA 5.1软件Neighbor-Joining法构建系统进化树，1 000次Bootstrap检验置信度。

1.2.6 药敏特性分析

参照NCCLS抗微生物药物敏感性实验执行标准采用纸片扩散法进行[19]。将XY4菌株接种于脑心浸出液培养基中，经28 ℃摇床振荡培养24 h，用无菌生理盐水稀释成浓度为106cfu·mL-1的菌悬液，取150 μL菌液均匀涂于水解酪蛋白琼脂上，贴上不同种类的药敏纸片，置于恒温培养箱中28 ℃培养24 h后测量各药敏纸片的抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 临床诊断

发病鲟养殖场养殖面积达26.67 hm2，发病死亡率达35%，发病持续了约1个月，发病鲟体长在30～40 cm，经济损失较大。养殖水体氨氮在0.05～0.10 mg·L-1，亚硝酸盐在0.01～0.03 mg·L-1，pH 7.5，溶氧7.0～8.9 mg·L-1，水温26～29 ℃。经光学显微镜镜检，未发现杂交鲟体内有寄生虫寄生，此次杂交鲟发病典型症状主要为杂交鲟游泳缓慢，不进食。体表无明显症状，解剖发现腹腔些许血水，肝脏灰白色，脾脏严重充血，肠道肿胀，肠壁较薄，炎症明显，肠道内有黄色黏液，肠道内无食物，见图1。

2.2 细菌分离

图1 病鱼的临床特征Fig.1 Clinical signs of moribund fish

从患病杂交鲟的肝、肾、脾及肠道中分离纯化到同一株优势菌XY4。经人工感染试验，试验组杂交鲟全部死亡，而对照组未出现异常。感染发病死亡的杂交鲟出现严重出血，脾脏充血发黑、肠道发炎等症状，与自然发病病症基本一致，并分离到与XY4相同的菌株，表明XY4株是杂交鲟肠炎的病原菌。根据表1建立试验鱼死亡率(%)与细菌剂量对数[lg(cfu)]的关系曲线：y=0.24x-1.3208(图2)，XY4菌株对杂交鲟的半致死剂量LD50=1.30×106cfu·g-1。

表1分离株对杂交鲟LD50试验结果

Table1Results of LD50of isolation strain in hybrid sturgeon

组别Group注射剂量Injecteddose/(cfu·unittail-1)实验鱼数量Testingfishnumber/unittail死亡数量Amountofdeath/unittail死亡率Mortality/%A84×1081010100B84×10710990C84×10610660D84×10510330E84×10410110F065%生理盐水Physiologicalsaline1000

2.3 细菌鉴定

经鉴定管反应测定了XY4菌株生化特性，结果见表2，理化指标初步确定菌株XY4为恶臭假单胞菌。将XY4菌株的16S rRNA基因序列与GenBank中已有序列进行Blast比对，结果显示XY4菌株与假单胞菌属种类同源性高(100%)。选取同源性高的假单胞菌属的16S RNA基因序列，构建系统发育树(图3)，结果显示XY4菌株与恶臭假单胞杆菌Pseudomonasputida显著聚为一枝。因此，结合理化特性，综合判定XY4菌株为恶臭假单胞杆菌P.putida。

2.4 药敏特性

图2 杂交鲟死亡率(%)与细菌剂量对数 [lg(cfu)]的关系曲线Fig.2 The relation curve of hybrid sturgeon mortality with logarithm of bacteria dose

表2菌株XY4的生理生化试验结果

Table2Biochemical characteristics of strain XY4

试验项TestitemXY4Pseudomonasputida[17]运动性Motility++精氨酸双水解酶Argininedihydrolase++脲酶Urease--柠檬酸盐Citrate++葡萄糖产气Glucosegas--葡萄糖产酸Glucoseacidproduction--H2S产生H2Sproduction--明胶Gelatin--氧化酶Oxidase++硝酸盐还原Nitratereduction++鸟氨酸脱羧酶Ornithinedecarboxyla--赖氨酸脱羧酶Lysindecarboxylase--V⁃P试验V⁃Ptest--乳糖Lactose--甲基红Methylred--果糖Fructose++木糖Xylose--阿拉伯糖Arabinose--麦芽糖Maltose--吲哚反应Indoletest--肌醇Inositol--接触酶Catalase++

+，阳性positive；-，阴性negative。

药敏试验结果(表3)显示：XY4菌株对头孢拉定、氟苯尼考及多西环素等9种抗生素高度敏感；对诺氟沙星、红霉素及新霉素等4种抗生素中度敏感；对苯唑西林、青霉素及阿莫西林等6种抗生素耐药。

图3 XY4菌株16S rRNA 基因序列与相关菌株的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of XY4 16S rRNA gene sequence and its relative strains

表3XY4菌株药敏试验结果

Table3Antibiotic sensitivity test of strain XY4

药物Drug抑菌圈直径判断标准Judgmentstandardofinhibitionzonediameter/mm耐药Resistant中度敏感Mediumsensitivity高度敏感Highlysensitive药物含量Dose/(μg·disc-1)抑菌圈直径Inhibitionzonediameter/mm敏感性Sensitivity环丙沙星Ciflox≤1516～20≥21522S苯唑西林Oxacillin≤1011～12≥1310R青霉素Penicillin≤1920～27≥2810∗14R头孢拉定Cefadroxil≤1415～17≥183020S阿莫西林Amoxicillin≤1314～17≥182013R呋喃唑酮Furazolidone≤1415～16≥173000R氯霉素Chloramphenicol≤1213～17≥1830022S氟苯尼考Florfenicol≤1213～17≥187522S克林霉素Clindamycin≤1415～20≥2120R诺氟沙星Norfloxacin≤1213～16≥171016I头孢噻肟Cefotaxime≤1415～22≥233014R红霉素Erythrocin≤1314～22≥231516I新霉素Neomycin≤1213～16≥173016I卡那霉素Kanamycin≤1314～17≥183017I多西环素Doxycycline≤1213～15≥163016S左氧氟沙星Levofloxacin≤1314～16≥17522S妥布霉素Tobramycin≤1213～14≥151020S庆大霉素Gentamicin≤1213～14≥151021S阿米卡星Amikacin≤1415～16≥173020S

S，高度敏感； I，中度敏感；R，耐药。*，青霉素含量的单位是U·片-1。

S， Highly sensitive; I， Medium sensitivity; R， Resistant. *， The dose of penicillin is U·disc-1.

3 讨论

3.1 恶臭假单胞菌的鉴定

恶臭假单胞菌分类地位为假单胞菌科、假单胞菌属，是革兰氏阴性杆菌。本试验通过革兰氏染色、形态学观察及微量生化鉴定管等研究了XY4菌株主要形态学及理化特征，结果表明XY4菌株为革兰氏阴性杆菌，形态学及理化特征亦与恶臭假单胞菌一致。此外，通过对XY4菌株的16S rRNA基因序列进行测序，经在GenBank中进行比对并构建系统发育树分析表明，分离菌株XY4与恶臭假单胞菌聚为一枝。因此，结合分离株XY4的形态学、理化特征及系统发育分析，综合判定菌株XY4是恶臭假单胞菌，而在人工感染发病死亡鲟体内相同部位亦分离到经鉴定与XY4即恶臭假单胞菌一致的菌株，故确定XY4株即恶臭假单胞菌为本次杂交鲟发病的病原菌。

3.2 恶臭假单胞菌的危害

恶臭假单胞菌在土壤及自然水体中分布广泛，在自然界中属正常菌群。恶臭假单胞菌具备较强分解能力，故可以将多种有机物作为能量来源，因此常被筛选为各种降解功能菌，尝试使用其作为环境改良剂用于废水处理等[20]。但随着研究的深入，发现恶臭假单胞菌也是一类条件致病菌，其致病性取决于鱼体生理状态及水环境的变化。恶臭假单胞菌在世界范围可以使得淡水鱼发病[21]。近年来，关于假单胞菌引起水生动物发病病例报道日趋增多，已报道恶臭假单胞菌可引起欧洲鳗鲡烂鳃病[22]、中华绒螯蟹爪无力[23]、条石鲷烂尾白浊病[18]、三疣梭子蟹牛奶病[24]、大鲵肝坏死病[25]、罗氏沼虾黄鳃和黑鳃病[26]、黑鲷肠炎[27]及大黄鱼内脏白点病[21，28]等。同时恶臭假单胞菌还是一种人-禽-鱼共患病原菌，据报道可以引起鸭[29]等禽类发病及造成人食物中毒[30]等。本研究从患肠炎病杂交鲟体内分离到恶臭假单胞菌病原，其症状与黑鲷肠炎病类似[27]，经感染试验，确定恶臭假单胞菌为杂交鲟致病菌。关于恶臭假单胞菌作为杂交鲟病原在国内尚属首次报道，表明恶臭假单胞菌感染养殖种类范围正在扩大，其危害性进一步增强。同时，鉴于恶臭假单胞菌还会对食品安全和人体健康构成一定威胁，加强其食源溯源传播的可能性研究十分必要。

3.3 杂交鲟肠炎病的药物防治

本研究测定了杂交鲟肠炎病致病菌XY4对19种抗生素的敏感性，研究结果表明，XY4株对头孢拉定、氟苯尼考及多西环素等9种抗生素高度敏感；对诺氟沙星、红霉素及新霉素等4种抗生素中度敏感；对苯唑西林、青霉素及阿莫西林等6种抗生素耐药。本研究分离菌株XY4对庆大霉素及多西环素高度敏感与任燕等[28]研究结果相同，而对氟苯尼考的高度敏感却与许斌福等[21]报道的不同，可能是因为菌株来源、地理环境及用药情况等不同造成的。经挑选高度敏感药物多西环素，参考水产用商品药说明书使用，配合复合维生素伴饵投喂5 d后病鲟停止死亡，7 d后大部分杂交鲟恢复正常摄食，经后续伴饵投喂大蒜素10 d巩固疗效，未出现新的死亡，取得了较好的治疗效果。

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Isolation，identificationandantibioticsensitivityofPseudomonasputidafromhybridsturgeon(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂)

YANG Yuanyuan1， YANG Yibin2，*， CAO Haipeng3， FANG Wei1， LIN Hanqun1， YANG Xianle3， AI Xiaohui2

(1.GuangdongProvincialCenterforAquaticAnimalDiseasePreventionandControl，Guangzhou510222，China; 2.YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Wuhan430223，China; 3.ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China)

The isolation， identification and antibiotic sensitivity of pathogen from the morbid hybrid sturgeon were conducted to provide a reference for control and prevention disease for hybrid sturgeon. The pathogenic bacteria were isolated and purified from liver， kidney， spleen and intestinal tract of hybrid sturgeon. The biochemical identification and 16S rRNA gene sequence determination and the artificial infection test were used to identify whether the strain XY4 was the pathogen， and the antimicrobial susceptibility test was conducted by K-B method. The results showed that strain XY4 was the pathogens of hybrid sturgeon， the LD50of the isolate was counted to 1.30×106cfu·g-1. According to morphological and biochemical characteristics as well as the result of 16S rRNA gene sequence analysis， the isolated strain XY4 wasPseudomonasputida. Strain XY4 was susceptible to cefadroxil， florfenicol， doxycycline and other 6 kinds of antibiotics. The disease caused byPseudomonasputidacan be prevented by above sensitive drugs in fishery farming.

Pseudomonasputida; hybrid sturgeon(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂); isolation and identification; antimicrobial susceptibility

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 1978-1985

http://www.zjnyxb.cn

杨圆圆，杨移斌，曹海鹏，等. 杂交鲟源恶臭假单胞菌的分离鉴定及药敏特性研究[J].浙江农业学报，2017，29(12): 1978-1985.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.04

2017-04-11

公益性行业(农业)科研专项(201503108-CC-1，201203085)

杨圆圆(1984—)，女，湖南娄底人，助理工程师，主要从事水生动物病害诊断及其防控技术研究。E-mail：ykyyy9@126.com

*通信作者，杨移斌，E-mail: yangyb1988@126.com

S941.42

A

1004-1524(2017)12-1978-08

(责任编辑卢福庄)