花椒窄吉丁后肠、粪便挥发物的提取与鉴定

巩雪芳 谢寿安 车显荣

摘要：采用正己烷浸提法提取花椒窄吉丁（Agrilus zanthoxylumi）后肠、粪便挥发物，应用GC-MS技术分析其化学组分和相对含量。结果表明，花椒窄吉丁成虫后肠挥发物种类和相对含量雌雄差异不大，主要为醛类和有机酸化合物，顺-9-十六烯醛在雌雄虫后肠挥发物中相对含量最高。雌虫粪便挥发物以烃类和醇类化合物为主，分别以正四十烷（21.16%）和叶绿醇（8.53%）相对含量为最高；雄虫以有机酸和烃类为主，分别以油酸（24.74%）和二十一烷（6.07%）相对含量为最高。雌、雄虫粪便挥发物种类和相对含量差异很大。

关键词：花椒窄吉丁（Agrilus zanthoxylumi）；正己烷；GC-MS；后肠；粪便

中图分类号：S763.38 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）20-0079-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.20.017 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Studying the specific component composition and relative content of the volatile components in the hindgut and feces of Agrilus zanthoxylumi，the volatile components were extracted by n-hexane and which were analyzed by GC-MS. The results showed that the main components of the volatile substances in the hindgut of females and males were aldehydes and organic acids. The relative content of cis-9-hexadecenal in the hindgut volatiles from females and males was the highest. The differences in species and relative content of feces volatile from females and males were great，the main components of the femals feces volatile were hydrocarbons and alcohols，tetracontane（21.16%） and phytol（8.53%） were the highest，while hydrocarbons and organic acids were the main components in males，oleic acid（24.74%） and heneicosane（6.07%） were the highest. The species and relative contents of volatile matter in feces of female and male insects were very different.

Key words： Agrilus zanthoxylumi； n-hexane； GC-MS； hindgut； feces

花椒窄吉丁（Agrilus zanthoxylumi Hou）隸属于鞘翅目（Coleoptera）吉丁虫科（Bupresdae）窄吉丁属（Agrilus），主要分布在中国北方花椒产区，如陕西、甘肃、山西、山东等省。在陕西省韩城、渭南、宝鸡、洋县、富平和甘肃省武都、天水、文县的花椒园区发生较为严重[1]。幼虫蛀食花椒树皮，成虫取食花椒叶片，造成缺刻、空洞[2]，在不同生育期，温度和湿度主要影响其活动[3]。研究发现，花椒窄吉丁危害程度与椒园的地势、地形和花椒品种无关[4]。目前对花椒窄吉丁的研究主要集中于化学防治和生物学特性方面[4-6]，利用天敌对其进行防控也有少量报道[7]，但关于信息素对花椒窄吉丁进行防治的研究尚未见报道[8]。

花椒窄吉丁在各地一年均发生一代，幼虫在花椒树皮坑道或木质部越冬，第二年2月至4月上旬开始活动，下旬开始化蛹，5月中下旬为化蛹盛期，蛹期大概28～43 d。6月中下旬为羽化盛期，7月中旬至8月初基本羽化完毕，成虫期8～21 d。雌虫产卵时沿着树干或枝条慢慢爬行，遇树皮缝隙、伤口及树枝分叉处则产卵。卵一般散产，少数2～4粒聚成一堆。单雌平均产卵量为32粒，每产1粒卵需1 min左右[9]。7月上旬为产卵盛期，卵期9～15 d。6月底幼虫开始孵化，7月中旬为孵化盛期。幼虫危害可持续至11月下旬，然后陆续越冬，整个幼虫期达240～280 d[3]。多年观察发现，幼树受害轻，老树受害重；未挂果树受害轻，挂果树受害重；且挂果越多受害越重，冻害有利于虫害的发生[10]。

利用昆虫信息素防治害虫是20世纪60年代以来发展起来的一种治虫新技术，与化学防治手段相比，它具有灵敏度高、选择性强、无毒、不污染环境、不杀伤天敌、不易产生抗药性等优势，已成为当今世界害虫综合管理的主要方向之一[11，12]；已经被广泛应用于害虫的测报和防治，特别是利用性信息素大量诱捕法和干扰交配法防治害虫。成虫粪便可能为昆虫找寻异性提供信号[13]，目前已经从许多小蠹科昆虫的后肠、粪便提取物中发现了具有生物活性的物质[10-12，14，15]。本研究主要通过对鞘翅目昆虫花椒窄吉丁雌雄成虫的后肠、粪便挥发性物质进行提取和鉴定，为花椒窄吉丁类信息素备选化合物的筛选及其寄主选择机制研究和绿色防控技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫 花椒窄吉丁成虫于2016年5-8月，采集于陕西省凤县白石铺村山地的花椒园。借助捕虫工具寻找在叶片、枝干上栖息的成虫迅速将其捕捉，根据体型大小分别放入扎好透气孔（4～10个）的4 mL或10 mL离心管中，每个离心管塞入一小片花椒叶片，雌雄虫各自进行编号记录后放入虫笼。带回实验室置于25 ℃下饲养，定期进行死虫清除和更换新花椒叶。

1.1.2 主要仪器 饲养瓶、解剖镜、解剖刀、滤纸、冰箱、ISQ气相色谱/质谱联用仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）、SPME手动进样手柄（美国Supelco公司）、固相微萃取搅拌加热平台、DVB/CAR/PDMS萃取头（纤维头）（美国Supelco公司）、DB-5MS弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、样品瓶、移液枪、组织研磨仪、分析天平、进样瓶等。

1.2 挥发物的制备

1.2.1 后肠挥发物的提取 将花椒窄吉丁成虫置于解剖镜下雌雄分开后立即解剖，确定前肠、中肠和后肠的位置，切下各自后肠和相关组织（包括一部分中肠、马氏管和脂肪体），立即放入装有1.5 mL冷却正己烷的棕色进样瓶中，雌雄成虫分别采集30根后肠，放入4 ℃冰箱静置48 h后过滤，将滤液转移至另一干净的进样瓶中，冷藏待用。

1.2.2 粪便挥发物的提取 将从野外采集到的花椒窄吉丁成虫雌雄分开饲养，分别收集其粪便，用分析天平各称取1 g，加入2 mL冷却正己烷中，置于4 ℃冰箱中48 h后过滤，去除其中杂质，将上清液转移至干净的2 mL棕色进样瓶中，冷藏待用。

1.3 挥发物的GC-MS分析与鉴定

采用直接进样法，应用气象色谱-质谱联用仪GCMS-QP2010 Ultra（岛津公司）对花椒窄吉丁雌性成虫后肠、粪便挥发提取物进行GC-MS分析。GC条件：进样口温度250 ℃，rxi-5ms弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温60 ℃，保持2.5 min，以6 ℃/min升至210 ℃，然后以10 ℃/min升至230 ℃，保持15 min，载气为高纯He（99.999%），流速为1.0 mL/min；不分流进样。MS条件：EI源，电离能为70 eV，离子源温度230 ℃。质量扫描范围为35～500 amu，质谱标准库为NIST库。

2 结果与分析

2.1 后肠挥发物GC-MS分析

2.1.1 花椒窄吉丁雌虫后肠挥发物的GC-MS分析 通过GC-MS对花椒窄吉丁雌虫后肠提取物定性定量分析。发现雌虫后肠挥发物中共鉴定出31种物质，占峰面积的99.96%，总离子见图1。其中，醛类化合物2种（总量42.37%），以顺-9-十六烯醛的相对含量最多（40.51%）；有机酸化合物6种（总量22.84%），以棕榈酸相对含量最多（13.90%）；酯类化合物3种（总量7.34%），以2-丙烯酸6-巯基酯含量最多（2.90%）；烃类化合物5种（总量5.42%），以正四十烷含量最多（3.51%）；醇类化合物3种（总量4.6%），此外，含少量的酮类、硅氧烷类化合物。

2.1.2 花椒窄吉丁雄虫后肠挥发物的GC-MS分析 雄虫后肠挥发物中鉴定共发现35种物质，占峰面积的100%，总离子见图2。其中，醛类化合物1种（总量57.08%），为顺-9-十六烯醛；有机酸化合物6种（总量20.45%），以棕榈酸相对含量最多（12.58%）；酯类化合物2种（总量4.79%），以2-丙烯酸6-巯基酯含量最多（3.68%）；烃类化合物10种（总量5.42%），以正二十烷含量最多（1.50%）；醇類化合物2种（总量1.37%）；此外，含少量的酮类、硅氧烷类等化合物。

2.1.3 花椒窄吉丁雌、雄虫后肠主要挥发物种类及相对含量的比较 通过花椒窄吉丁雌、雄虫后肠挥发物的GC-MS总离子图，采用峰面积归一化法求出挥发性物质中各组分的相对含量，应用GC-MS和计算机联机系统对各组分定性，并结合有关资料人工检索确定其化学组成。

花椒窄吉丁雌雄虫后肠主要挥发物（相对含量>0.5%）的比较见表1。研究发现，花椒窄吉丁雌、雄成虫后肠挥发物中分别含有31种、35种化学成分，以醛类和有机酸类为主，比较花椒窄吉丁雌、雄虫后肠主要的挥发性物质在化学组成及相对含量上的差异，雌、雄虫后肠挥发物都是以顺-9-十六烯醛含量最多，其次是棕榈酸，认为是其后肠挥发物的主要成分，可见雌、雄虫后肠主要挥发物在化学组成及相对含量上均无明显差异。

2.2 粪便挥发性物质GC-MS分析

2.2.1 花椒窄吉丁雌虫粪便挥发物的GC-MS分析 根据花椒窄吉丁雌虫粪便总离子流气相色谱图检测出共83种物质，占峰面积的99.34%，总离子见图3。其中，烃类化合物12种（总量52.11%），相对含量最多为正四十烷（21.16%）；醇类化合物18种（总量16.65%），相对含量最多为叶绿醇（8.53%）；酯类化合物16种（总量9.54%），含量最多的为丁基十七烷亚硫酸酯（3.24%）；酮类化合物12种（总量6.23%），含量最多的为胆甾-3，5-二烯-7-酮（2.88%）；有机酸化合物7种（总量3.71%）；此外，含少量的萜烯类、苯酚等化合物。

2.2.2 花椒窄吉丁雄虫粪便挥发物的GC-MS分析 由花椒窄吉丁雄虫粪便总离子气相色谱图检测出共85种物质，占峰面积的99.99%，总离子见图4。其中，有机酸化合物10种（总量59.80%），相对含量最多为油酸（24.74%）；烃类化合物12种（总量14.82%），相对含量最多为二十一烷（6.07%）；酯类化合物20种（总量10.03%），含量最多为L-抗坏血酸棕榈酸酯（5.22%）；酮类化合物12种（总量6.23%），相对含量最多为叶绿醇（5.41%）；此外，含有少量的萜烯类、酮类、醛类等化合物。

2.2.3 花椒窄吉丁雌、雄虫粪便主要挥发物种类及相对含量的比较 花椒窄吉丁雌、雄虫粪便主要挥发物（相对含量>0.5%）的比较结果（表2）表明，雌、雄成虫粪便挥发物中分别含有83种、85种化学成分，雌虫主要为烃类和醇类（占68.76%），雄虫主要为有机酸和烃类（占74.62%），可知粪便挥发物组成在性别上差异明显。花椒窄吉丁雌、雄成虫粪便挥发物在化学组成及相对含量上除2-羟基桉叶素和二十一烷外差异显著，雌虫粪便挥发物的主要成分是烷烃（三十六烷和四十烷），而雄虫粪便挥发物的主要成分是有机酸（棕榈酸和油酸）。

3 小结与讨论

昆虫粪便在寄生性和捕食性天敌的生态关系中扮演重要角色[16，17]，也是寄主的选择和定位行为的信息素来源[18]，粪便的化学信号与幼虫紧密相关，这样能对幼虫找寻寄主提供更有效的信息[19，20]。对沙漠蝗的聚集行为研究后认为卵囊、粪便、虫体都产生不同的信息素[21]，故分析引起花椒窄吉丁雌、雄虫粪便挥发物组分在性别上的差异可能的原因是雌、雄虫性信息素的形成需特异性选择消化吸收，从直肠排出的物质也有不同，而起初进食都是相同的，也能解释后肠挥发物差异不大，这又进一步说明性诱剂的研发更需要参照粪便排泄物。

本研究在花椒窄吉丁后肠挥发物中大量发现的顺-9-十六烯醛已被证明是多种昆虫[22-25]的信息素成分，并已被研发成性诱剂，关于顺-9-十六烯醛是否是花椒窄吉丁的性信息素成分还有待通过生物学等活性测定方法继续深入探讨。

正己烷浸提法是常用的提取昆虫后肠和粪便挥发物的方法，前人已有很多研究[26-28]，但是不能够完全有效地提取昆虫后肠和粪便的挥发物成分，会带来杂质，存在损失。吴丹等[29]在2017年研究了一种快速分析人和大鼠粪便中碱性和中性挥发性代谢产物的气相色谱-质谱联用法，简单、灵敏，可用于粪便样品中碱性和中性挥发性代谢产物的分析。但是想要得到昆虫后肠和粪便挥发物成分的准确分析，建议今后选择损失更小的挥发物提取方法。如固相微萃取技术，一种无需溶剂的挥发物质快速提取法，准确性高，重现性好，能够更加真实地反映所萃取样品中挥发性物质的真实成分和各成分比例，成为近年来挥发性物质研究的主要手段。

植食性昆虫表皮分泌的化学信息物质对其行为也有很重要的作用[30]，此外蝗虫表皮抽提物中也有聚集信息素的存在[31]。Peterson等[32]提取了表皮碳氢化合物并分析其在雄性交配选择和生殖隔离的作用。表明今后对于花椒窄吉丁昆虫信息素还有很广泛的领域有待深入探究，要想实现对其进行综合防控，更需探究其表皮分泌的化学信息物质。幼虫粪便也能够驱避雌性成虫产卵在其附近，以减少后代的竞争。鞘翅目松墨天牛幼虫的粪便就有这种产卵忌避作用[33]。所以期望在今后对花椒窄吉丁研究中也能够实现对其幼虫粪便成分及其相对含量分析，以期丰富花椒窄吉丁的昆虫信息素物质种类；为进一步揭示花椒窄吉丁寄主侵害机理提供理论依据，为今后可持续治理农林业害虫提供技术支撑。

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