香水莲花多糖的提取分离及结构测定

姜洪芳，周浩宇，石宝俊，单承莺,徐 辉,3，张 玖，张卫明

(1.南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042；2.安徽省合肥市肥东二中，安徽肥东231600；3.中国药科大学 生命科学与技术学院，江苏 南京211198)

香水莲花多糖的提取分离及结构测定

姜洪芳1，周浩宇2，石宝俊1，单承莺1,徐 辉1,3，张 玖1，张卫明1*

(1.南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042；2.安徽省合肥市肥东二中，安徽肥东231600；3.中国药科大学 生命科学与技术学院，江苏 南京211198)

依次采用水提醇沉及十六烷基三甲基溴胺盐 (CTAB) 沉淀法得到香水莲花酸性多糖(ADT)，利用萄聚糖凝胶 Sephadex G-150 进行柱层析，得到了主要组分ADT-Ⅱ，高效凝胶色谱法测定其分子量为2.758×105Da；ADT-Ⅱ的酸水解产物经过薄层层析、高效液相色谱法、13CNMR 分析，结果表明ADT-Ⅱ的单糖组成是以甲酯化的半乳糖醛酸为主，同时还含有少量的半乳糖和甘露糖。

香水莲花多糖；提取分离；结构鉴定

香水莲花 (Nymphaeahybrid) 是睡莲科睡莲属热带大型睡莲，是一种多年生宿根水生花卉。20世纪70年代我国台湾园林部门在引进美国香莲的基础上，经过多年选育，现已培育出金、黄、红、紫、蓝、赤、绿等9种深浅不同的花色品种[1]。这些品种具有一定的耐寒性能。在适宜的温度下可全年不间断地开花，单株产花量居世界各种荷花或莲花之冠。香水莲花不仅花朵硕大、色彩鲜艳，更为难得的是它们同时还具有清雅宜人的香气。可以说，香水莲花集当今世界各地荷、莲珍贵品种之优点于一身，因而成为备受青睐的园林水生观赏花卉。近年来我国南方数省已开始引种，并且发展到了一定的规模。与此同时，源于香水莲花的各种产品也开始不断开发，有以子房连同雄蕊一起经高温烘焙制成的香水莲花茶，也有以其提取物制成的九品莲花酒，等等。一些爱美的女士也闻风而动，以香水莲花子房中的胶质敷面，据说有很好的美容效果。有资料称[2]，香水莲花的鲜花可供生食，亦可泡茶、浸酒或随其他食物炖煮。植物多糖的生理功能较为广泛，据资料报道多糖具有免疫调节功能、降血脂、降血糖、抗衰老等作用。本实验以香水莲花为研究对象，采用水提、乙醇沉淀法得到香水莲花粗多糖。粗多糖经十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 沉淀、透析等初步纯化后，以Sephadex G-150 柱层析为手段进一步纯化，采用高效凝胶色谱法 (HPGPC) 鉴定其是否为均一组分，及分子量分布范围，利用13CNMR、高效液相色谱法 (HPLC)、薄层层析 (TLC) 分析纯化多糖酸水解产物的结构。本研究为香水莲花多糖的进一步应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

香水莲花七月采摘，立即风干。经南京野生植物综合利用研究院张卫明研究员鉴定为Nymphaeahybrid。使用前在80 ℃烘箱中干燥0.5 h，粉碎后过20目筛备用。

1.2 仪器和试剂

Sephadex G-150及标准分子量葡聚糖Dextran T10, T40, T70, T90, T500均为 Pharmacia 公司产品；各标准单糖、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、苯酚等均为市售分析纯试剂或生化试剂。

HPLC分析仪为Agilent 1200，色谱柱为ZORBAX Carbohydrate柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，凝胶柱为TSK-gel 中的GMP WXL(300 mm × 7.8 mm)，示差折光检测器。BRUKER AVANCE 500 型核磁共振仪。Sephadex G-150 凝胶层析柱为2.6 cm×100 cm玻璃柱，床体积为450 mL。

1.3 提取与分离

取香水莲花粗粉10 g，加25倍体积水在100 ℃水浴中热浸4～5 h，纱布初滤，离心。药渣同法再浸提2次，合并3次上清液，上清液经旋转蒸发仪70 ℃减压浓缩至原体积的1/5，向浓缩液中加入95% 乙醇进行沉淀，当加入的乙醇浓度达到60% (体积含量) 的时候，有大量絮状沉淀出现，静置24 h，离心。沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，真空干燥，得粗多糖，配制2%的粗多糖溶液，离心除去不溶性物质，加入10% (W/V) CTAB溶液，静置过夜后离心 (10 000 g) 30 min，得到上清液和沉淀。沉淀中加入10% (W/V) NaCl溶液，以离解沉淀复合物[3-4]，然后再分别用乙醇、丙酮和乙醚进行沉淀和洗涤，干燥后得酸性多糖(ADT)粗品。上清液分别用乙醇、丙酮和乙醚沉淀，干燥后得中性多糖(NDT)粗品。因中性多糖仅占粗多糖含量的11%，含量较低，故未做进一步的探讨。酸性多糖的粘度很大，故先用复合果胶酶进行酶解以降低其粘度，离心，上清液流水透析2天，浓缩得到的溶液，经Sephadex G-150凝胶层析进一步纯化，以正丁醇饱和水溶液洗脱，流速为0.5 mL/min。分部收集，硫酸-苯酚比色法跟踪检测，绘制洗脱曲线，合并相同组分，冷冻干燥得纯化多糖ADT-Ⅰ和ADT-Ⅱ。

1.4 纯度检查和分子量测定

采用HPLC法检查所得多糖 (ADT-Ⅱ) 的纯度和测定分子量。柱为TSK-gel中的GMP WXL(300 mm×7.8 mm ID)，流动相为水，流速为0.6 mL/min，25 ℃，根据峰形判断样品纯度。分别测定5种标准Dextran样品 (分子量依次为10 000、40 000、70 000、500 000、2 000 000 Da) 的保留时间，以分子量的对数值对保留时间作图求得标准曲线，并求出回归方程。按同样的条件测定样品ADT-Ⅱ的HPLC保留时间，由回归方程求得ADT-Ⅱ的平均分子量。

1.5 结构测定

1.5.1 薄层层析

将样品ADT -Ⅱ5 mg置于安培管中，加入2 moL/L三氟醋酸2 mL，封口，110 ℃水浴解4 h。水解液加蒸馏水稀释后，40 ℃用旋转薄膜蒸发仪反复处理，抽走三氟醋酸至水解液为中性，适当浓缩后，进行纤维素TLC，展开剂为EtOAc-Pyridine-HOAc-H2O (5∶5∶1∶3)，显色剂为苯胺-邻苯二甲酸。与标准单糖的R值进行比较，确定样品中的单糖种类。

1.5.2 高效液相色谱法

ADT-Ⅱ的完全酸水解产物与标准单糖的保留时间进行HPLC分析，色谱柱为ZORBAX Carbohydrate柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为V(CH3CN)∶V(水)=80∶20，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃。

1.5.3 核磁共振谱 (NMR) 测定

取ADT-Ⅱ完全酸水解后的样品约20～30 mg，经真空干燥枪充分干燥后，测定13C NMR谱，从中获取糖单元组成信息。

2 结果与分析

2.1 酸性多糖 (ADT) 经 Sephadex G-150的纯化

香水莲花粗多糖经Sevage法去除蛋白后，利用十六烷基三甲基溴化铵络合法分离香水莲花粗多糖 (XLDT) 中酸性多糖 (ADT) 和中性多糖 (NDT)，酸性多糖经复合果胶酶酶解后，流水透析，得到的溶液浓缩，经Sephadex G-150进一步纯化，得到两个洗脱峰，冻干后得到两个多糖组分ADT -Ⅰ(7～40管) 和ADT -Ⅱ(58～106管)。其中ADT-Ⅰ含量很少，仅占16.8%，而且颜色很深，初步估计其中含有较多的色素杂质。薄层层析分析，ADT-Ⅰ所含的组分复杂，是一个混合物。根据洗脱曲线的峰面积判断，ADT -Ⅱ是香水莲花酸性多糖的主要组成部分，大约占到多糖总量的80%以上，因而也是本文多糖分子结构研究的主要对象。凝胶层析图见图1。

2.2 ADT -Ⅱ纯度及分子量的HPGPC法检查结果

经HPGLC检测，ADT -Ⅱ基本上为单一的对称峰 (图 2)，小肩峰的面积占总峰面积的5%以下，不影响波谱解析。

图1 香水莲花酸性粗多糖(ADT)的Sephadex G-150柱层析洗脱曲线

图2 ADT -Ⅱ的HPGPC 检测结果

标准Dextran (分子量分别为10 000，40 000，70 000，500 000，2 000 000 Da) 的分子量对数与保留时间的回归方程为lgM=-0.309 5t+8.510 5 (R2=0.992 4)，由回归方程求得ADT -Ⅱ的平均分子量为2.758×105Da。

2.3 ADT -Ⅱ的组成分析

ADT -Ⅱ的完全酸水解产物薄层层析的结果见图 3，与标准单糖的保留时间对比，ADT -Ⅱ的完全酸水解产物的HPLC分析结果见表 1。ADT -Ⅱ及完全酸水解产物的核磁共振谱见图4、5。

表1 ADT -Ⅱ单糖组成的HPLC分析结果

图3 ADT -Ⅱ的薄层层析结果

图4 香水莲花多糖ADT -Ⅱ 的13C谱

图5 香水莲花多糖ADT -Ⅱ-SJ 的13C谱

3 讨 论

结合上述测定结果可以看出，香水莲花水提浓缩液经乙醇沉淀得到香水莲花粗多糖，约占原料干重的12%左右。该粗多糖中以酸性多糖ADT 为主，ADT能与十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 络合形成沉淀，从而得以与混杂其中的少量中性多糖相互分离。酸性多糖ADT 水溶液的粘度很大，未经适当降解(降粘)处理，很难通过凝胶柱层析进行分离。复合蛋白酶对它的粘度几乎没有影响，表明它不是一个蛋白结合多糖。以复合果胶酶在适当条件下处理，可以使其水溶液的粘度下降50%左右，提示ADT中含有果胶或果胶结构片段。经果胶酶初步降解后的酸性多糖ADT 通过Sephadex G-150分离，得到两个洗脱峰ADT -Ⅰ和ADT -Ⅱ，其中又以ADT -Ⅱ为主。高效凝胶色谱法测得ADT -Ⅱ的平均分子量为2.758×105Da。ADT -Ⅱ的化学结构相当复杂：不仅13C核磁共振谱在δ56.1处的甲氧基信号和δ173.2处的酯羰基信号证实了其中有果胶或果胶结构片段存在，而且因为在δ100～106 ppm区间内至少有6个端极碳信号，表明了组成ADT -Ⅱ的糖基单元在种类和构型上具有多样性。ADT -Ⅱ的三氟醋酸全水解产物经HPLC分析检出4个主要的单糖峰，其中两个尚未定性，其余两个已经分别被确认为半乳糖、甘露糖。除此之外，由于在现行的HPLC分析条件下无法检出半乳糖醛酸(不出峰)，ADT -Ⅱ中是否存在半乳糖醛酸需要根据其他分析结果另行判定。与此同时，作为香水莲花粗多糖XLDT主要组成部分的酸性多糖ADT -Ⅱ，其13C核磁共振谱中出现了相当强的糖醛酸甲酯信号。因此，酸性多糖ADT -Ⅱ除了少量的半乳糖、甘露糖等单糖基之外，甲酯化了的半乳糖醛酸是其主要结构单元，至少要占总糖基的一半以上。ADT -Ⅱ结构进一步鉴定和活性测定工作仍在进行中。

[1] 陈培栋.‘九品香水莲花’问世[J]. 中国花卉园艺, 2003, 24：38-41.

[2] 崔亦华, 崔英德, 易国斌. 应用广泛的天然多糖及其提取方法[J]. 广州化工, 2002, 3(30): 7-9.

[3] HARUKI Y，YUKIO O, TOSHIO M. Characterization of extracellular mannoheteroglyeans fromAbsidiacylindrospora[J]．Chem Pharm Bull, 1982, 3o(5): 1784-1788.

[4] 乔善义, 王立岩, 赵毅民, 等. 山药多糖的提取分离和结构测定[J].中国天然药物, 2003, 1(3): 155-156.

Extraction,IsolationandStructuralDeterminationofthePolysaccharidesfromNymphaeahybrid

Jiang Hongfang1, Zhou Yuhao2, Shi Baojun1, Shan Chengying1, Xu Hui1,3, Zhang Jiu1, Zhang Weiming1*

(1. Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042,China; 2.The Second Middle School of Feidong, Feidong 231600, China; 3. College of Life Scienceand Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China)

Acidic polysaccharide (ADT) was obtained with water extraction，alcohol and CTAB precipitation fromNymphaeahybrid. Through the column of Sephadex G-150 ADT was further separated and ADT-II is the main part. The molecular weight of ADT-II was determined to be about 2.7×105Dalton by high performance gel permeation chromatogram (HPGPC) technology. After complete hydrolysis in acid,the hydrolysate of ADT-II was analyzed by nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum, high performance liquid chromatography (HPLC) and TLC. The result showed that ADT-II was mainly made up of galacturonic acid, and with galactose and mannose as the minor parts.

Nymphaeahybrid; polysaccharides; structural determination

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.06.005

2017-04-18

国家重点研发计划(2017YFD0601305)。

姜洪芳,副研究员，主要研究天然产物活性物质应用与开发。E-mail:jhf74@163.com

*通讯作者：张卫明。E-mail: botanyzh@163.com

R284.2

A

1006-9690(2017)06-0019-04