棉花种子中转基因成分筛查策略

张海波 ，张英 *

（1.陕西省种子管理站，西安710018；2.农业部农作物种子质量监督检验测试中心(西安)，西安710018）

棉花种子中转基因成分筛查策略

张海波 1，2，张英 1，2*

（1.陕西省种子管理站，西安710018；2.农业部农作物种子质量监督检验测试中心(西安)，西安710018）

2015年中国棉花产量560万t[1]，约占世界棉花产量的四分之一[2]。棉花棉铃虫在中国各棉区普遍发生[3]，转基因抗虫棉的大规模应用，有效地降低了棉铃虫的危害[4-5]。2015年，中国转基因抗虫棉种植面积为370万hm2[6-7]，国产转基因抗虫棉已占到99%的市场份额[8]。

由于转基因技术的潜在风险，转基因作物在应用前必须经过安全性评价[6]。棉花是中国目前唯一转基因商业化种植的主要农作物，加强对转基因棉花种子的监管，是转基因棉花种子产业健康发展的重要保障[9-10]。棉花种子的转基因监管，包括对非转基因棉花种子（未标注“转基因”字样的棉花种子）的监管和对转基因种子（标注“转基因”字样的棉花种子）的监管。对非转基因棉花种子的监管主要是防止转基因种子混入非转基因种子中非法扩散；对转基因种子的监管主要是测定转基因种子的特征特性纯度。种子检验是种子监管的技术支撑，以上两方面的监管将产生大量需要检测的样品。快速、准确、科学地对大量样品进行转基因成分检测，是当前转基因成分检测技术所面临的一个关键问题[11]。聚合酶链式反应 （Polymerase chain reaction，PCR）技术以其敏感、快速、简便等特点，成为最适合转基因作物及其产品快速检测的技术[12]。以PCR技术为基础的筛查法检测，适合对大量样品进行转基因成分检测。中国棉花种子市场主要是国内抗虫棉品种，因此，监管的重点也是国内批准的转基因抗虫棉。本研究根据中国转基因抗虫棉种子市场情况，分析了抗虫棉常用的插入基因和调控元件，选取合适的基因元件组合，建立转基因棉花筛查的靶标元件和检测方法，并对转基因棉花种子的转基因特征特性纯度检测进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

非转基因棉花种子新陆早36号，转Bt基因棉花种子中植棉2号、中棉所41、中棉所45、中棉所79、鲁棉研21号、鲁棉研28号、鲁棉研29号、鲁棉研36号、鲁6269、鲁7619、K836和瑞棉1号，由陕西省农作物种子检验站收集；某转基因抗虫棉商品种子，购自雨润西安农副产品全球采购中心粮油种子销售区。

PCR 扩增试剂（Premix ExTaq，R003A）、DNA分子质量标准（Marker DL1000，货号：3591A）购自宝生物工程（大连）有限公司。扩增引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2 转基因棉花安全证书批准情况分析

转基因棉花品种在商业化应用前必须经过转基因生物安全性评价[6]，通过安全性评价的授予《农业转基因生物安全证书》。根据农业部“转基因权威关注”网站中“审批信息”板块相关内容[13]，查询了我国自1996年安全性评价申报以来，至2016年获批《农业转基因生物安全证书》的转基因棉花品种，对其转入的外源基因进行了分析归类和统计分析，以此作为转基因棉花筛查策略分析的基础。

1.3 转基因棉花筛查策略分析

转基因棉花的筛查是对转基因棉花中通用元件进行检测。根据转基因棉花的外源插入元件情况，挑选使用频率最高和覆盖全部已知转基因棉花的少数几个外源元件作为检测靶标，如果检测出其中任何一个元件，表明该样品中含有转基因棉花。如果检测结果都为阴性，则表明样品中未检出已知转基因棉花[14]。根据转基因棉花筛查原则和转基因棉花安全证书批准情况，确定转基因棉花检测的筛查策略。

1.4 基因组DNA提取

样品基因组DNA的提取采用天根生化科技（北京）有限公司生产的新型植物基因组DNA提取试剂盒 （货号：DP320）。用紫外分光光度计ND2000（赛默飞世尔科技公司，Thermo Fisher Scientific）测定获得DNA的纯度和质量浓度。8 g·L－1琼脂糖凝胶电泳和EB染色检测DNA样品的完整性。棉花内标准基因SadⅠ扩增[15]测定DNA样品中是否存在扩增抑制物质。

1.5 定性PCR

筛查元件的定性PCR引物采用国家标准中的引物，包括农业部1485号公告-11-2010《转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因棉花定性 PCR方法》[16]、农业部 1782号公告 -3-2012《调控元件CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、NOS启动子、NOS终止子和CaMV 35S终止子定性PCR方法》中CaMV 35S启动子和NOS终止子扩增引物[17]，具体引物的序列和扩增产物大小如表1所示。

定性PCR扩增条件及扩增程序依据相应标准[15-17]执行。定性PCR扩增使用MyCycler PCR仪（美国伯乐（Bio-red）)进行扩增，PCR 产物用 20 g·L－1琼脂糖凝胶电泳和EB染色。

表1 检测中所用的引物扩增片段长度及引用标准

1.6 转基因棉花筛查检测方法特异性分析

为了验证选择的Bt基因、CaMV 35S启动子和NOS终止子筛选引物是否适合对棉花中的转基因成分进行筛查，利用表1中的引物对12个转基因棉花种子进行了试验验证，分别是中植棉2号、中棉所41、中棉所45、中棉所79、鲁棉研21号、鲁棉研28号、鲁棉研29号、鲁棉研36号、鲁6269、鲁7619、K836和瑞棉1号。以新陆早36号作为非转基因棉花对照。

1.7 转基因棉花筛查检测方法灵敏度分析

用不同质量比例的转基因棉花中棉所41种子粉末和非转基因棉花新陆早36号种子粉末混合，提取基因组DNA，对Bt基因、CaMV 35S启动子和NOS终止子的筛查方法进行灵敏度测试。种子粉末混合比例分别是：中棉所41（转基因成分含量1 000 g·kg－1）、10.0 g 的中棉所 41 和 90.0 g 的新陆早 36 号混合 （转基因成分含量 100 g·kg－1）、1.0 g的中棉所41和99.0 g的新陆早36号混合（转基因成分含量 10 g·kg－1）、0.50 g 的中棉所 41 和 99.50 g的新陆早36号混合（转基因成分含量5 g·kg－1）、0.10 g的中棉所41和99.90 g的新陆早36号混合（转基因成分含量 1 g·kg－1）、0.10 g 的中棉所 41 和999.90 g的新陆早36号混合 （转基因成分含量0.1 g·kg－1）、新陆早 36 号（转基因成分含量 0 g·kg－1）。

1.8 转基因抗虫棉特征特性纯度检测分析

转基因抗虫棉特征特性纯度的测定采用Bt基因检测方法。对市场上购买的某转基因抗虫棉商品种子，随机抽取125粒种子，以每粒为1个样品进行核酸提取和Bt基因的检测，以测定该转基因抗虫棉商品种子的抗虫特征特性纯度。

2 结果与分析

2.1 商业化转基因棉花外源插入元件分析

根据农业部“转基因权威关注”网站中“审批信息”内容[13]，我国1996年至2016年批准棉花《农业转基因生物安全证书》共计2 514份。棉花的《农业转基因生物安全证书》有效期为5年，截至2017年10月仍有效的安全证书有863份，全部为抗虫转基因棉花。其中，转cry1Ab/cry1Ac棉花766份，占863份的88.8%；转cry1Ac棉花71份，占 8.2%；转cry1Ab/cry1Ac+CpTI棉花 26份，占 3.0%（图1）。

图1 2012－2016年转基因抗虫棉获得生产应用的安全证书

从图1可看出，2011年到2016年批准的棉花农业转基因生物生产应用安全证书分别为40份、129份、236份、142份、165份和191份。批准的所有转基因棉花都是抗虫棉，并且都有cry1Ab/cry1Ac融合基因或者cry1Ac抗虫基因中的1个。

2.2 转基因抗虫棉筛查策略分析

根据商业化转基因棉花外源插入元件分析结果，我国批准的转基因棉花都是转基因抗虫棉，含有cry1Ab/cry1Ac融合基因或cry1Ac抗虫基因中之一，因此对转基因棉花的筛查检测，首先是针对cry1Ab/cry1Ac融合基因或cry1Ac基因或cry1Ab基因的检测。农业部1485号公告-11-2010标准中的Bt基因检测方法，是根据cry1Ab/cry1Ac融合基因或cry1Ac基因或cry1Ab基因序列设计的特异性方法[16]，可检出cry1Ab/cry1Ac融合基因或cry1Ac基因或cry1Ab基因序列。

完整的Bt基因表达盒才能实现Bt基因的表达和抗虫特性的发挥，即需要启动子和终止子的协同作用。国产抗虫棉主要采用CaMV 35S启动子和NOS终止子实现对Bt基因的调控[18-19]，本研究选用农业部1782号公告-3-2012中的CaMV 35S启动子和NOS终止子检测方法[17]，对转基因抗虫棉的调控元件进行筛查检测。

2.3 转基因抗虫棉筛查检测方法特异性

PCR检测结果如图2所示，在Bt基因 （图2A）、CaMV 35S 启动子（图2B）和 NOS 终止子（图2C）方法的检测结果中，所有的转基因抗虫棉都可检出，非转基因棉花为未检出。这些结果与预期相符，说明本研究中选用的Bt基因、CaMV 35S启动子和NOS终止子的筛查检测方法，能够有效地对转基因抗虫棉进行筛查检测。

图2 对棉花基因组DNA中Bt基因、CaMV 35S启动子和NOS终止子的PCR检测

2.4 转基因抗虫棉筛查检测方法灵敏度

PCR检测结果如图3所示，在Bt基因 （图3A）、CaMV 35S 启动子（图3B）和 NOS 终止子（图3C）方法的检测结果中，转基因成分含量1 g·kg－1的混合样品可以检测到，转基因成分含量0.1 g·kg－1的混合样品未扩增出条带，说明本研究选用的引物序列的灵敏度可达到1 g·kg－1。

图3 对棉花基因组DNA中Bt基因、CaMV 35S启动子和NOS终止子的PCR检测灵敏度

2.5 转基因抗虫棉特征特性纯度检测

根据孙国清等[20]的研究，转基因抗虫棉品种抗性纯度会影响产量。转基因抗虫棉品种抗性纯度至少要达到97%，才可以保证产量不至于损失太大[20]。国家标准强制性要求棉花大田用种的纯度不能低于95%。综合考虑，转基因抗虫棉品种抗性纯度至少要达到97%，才能保证棉花种植农田不受损失。

对市场上购买的某转基因抗虫棉种子的125个单粒PCR检测结果显示，有122个呈阳性，有3个单粒（序号分别是41、67和120）为阴性（图4），计算出转基因抗虫棉种子的纯度为97.6%。说明该抗虫棉种子的抗虫抗性纯度符合要求，能够在大田中有效防止棉铃虫的侵害。

图4 采用Bt基因法检测转基因抗虫棉特征特性纯度结果

3 讨论与结论

本研究通过对转基因棉花农业转基因生物安全证书批准数据进行分析，统计了商业化转基因棉花外源插入元件的情况，提出了转基因抗虫棉筛查策略和检测方法，使用Bt基因、CaMV 35S启动子和NOS终止子检测方法对12个常见转基因棉花品种进行筛查检测的试验验证。试验结果证明，该检测方法对商业化应用的转基因棉花品种可进行特异性的快速筛查检测，检测灵敏度可达到1 g·kg－1，这与吴明生等[21]、Wu 等[22]报道的检测灵敏度相近，为棉花中转基因成分的快速准确检测提供了技术依据。

Bt基因筛查方法可对棉花的转基因特征特性纯度进行快速分析。该方法具有以下优势：相对于常规的种子纯度检测方法，节约了时间成本；可实现种植前种子纯度检测和控制，最大限度减少纯度不合格种子对大田生产的负面影响。

该技术应用于转基因抗虫棉的监管，对于防止转基因抗虫棉的非法扩散和保障棉田的安全生产具有重要意义。

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Screening Strategy for Detection of Genetically Modified Organism in Cotton Seed

Zhang Haibo1,2,Zhang Ying1,2*

在棉花种子的监管中，大量的样品需要进行转基因成分检测，建立快速、准确、低成本的转基因成分筛查方法十分必要。通过分析我国棉花种子市场和转基因棉花安全生产证书发放情况，建立了棉花种子中转基因成分快速筛查策略，并对市场上销售的棉花品种种子转基因特征特性纯度进行了检测。结果表明，联合使用CaMV 35S启动子、NOS终止子和Bt基因等3个元件的检测，可完成对棉花种子中转基因成分的快速筛查，检测灵敏度为1 g·kg－1；单用Bt基因可对抗虫棉种子的转基因特征特性纯度进行快速检测。本研究建立的筛查方法，可对棉花种子中转基因成分进行快速、高灵敏度的筛查。

转基因棉花；转基因检测；筛查策略；抗性纯度；Bt基因

S562.03

A

1000-632X(2017)12-0011-05

10.11963/1000-632X.zhbzy.20171124

2017-10-11 *通信作者：zhying6@gmail.com

国家重点研发计划——“七大农作物育种”专项（2017YFD0102006）