青刺果总黄酮超声波辅助提取及其抗氧化活性

刘招娣，刘祥义，张水滔,林早琴，李云仙，徐娟

（西南林业大学化学工程学院，云南昆明 650224）

青刺果总黄酮超声波辅助提取及其抗氧化活性

刘招娣，刘祥义，张水滔,林早琴，李云仙，徐娟*

（西南林业大学化学工程学院，云南昆明 650224）

以青刺果油粕为原料，利用超声波辅助提取总黄酮，通过单因素试验探究各因素对青刺果总黄酮得率的影响及正交试验确定最佳工艺参数。并以VC和BHT为对照，对其还原性及羟自由基·OH和超氧阴离子自由基O2-·的清除能力进行测试。结果表明：最佳提取工艺条件为乙醇浓度60%，提取温度60℃，提取时间35min，料液比1∶30（g/mL），此条件下总黄酮的得率为5.28%。按其工艺条件制备青刺果黄酮具有较强的体外抗氧化活性，其抗氧化能力低于VC，与BHT相当。

青刺果；总黄酮；超声辅助提取；抗氧化活性

青刺果（Prinsepia utilis Royle），蔷薇科（Rosaceae）扁核木属（Prinsepia）植物总花扁核的果实，别名青刺尖、打油果[1-2]。其根、叶、果、均可入药或食用，具有清热、解毒、活血、消炎、止痛、消食、健胃等作用[3-4]。果仁可供榨油食用，榨油后的残渣即油粕，可以作为上等饲料，也是传统食用或药用部位，其中亦含有较多活性物质，其主要有效成分为黄酮和多糖类[5-6]。黄酮类成分具有优良的抗过敏、降血脂、抗菌、免疫调节、止咳、平喘、消炎、祛痰、护肝、抗肿瘤等方面的作用[7-9]。其常用的提取方法有：超临界流体萃取、水蒸气蒸馏、溶剂浸提和超声波提取等[10-11]。超声波提取法具有时间短，减少溶剂消耗、降低生产能源及减少废物的排放等优点而被广泛应用[12]。目前，采用超声波提取青刺果总黄酮及其体外抗氧化活性的文献鲜有报道。本研究以青刺果油粕为原料，采用超声波辅助提取总黄酮，再研究其抗氧化活性，为青刺果黄酮的开发与利用提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青刺果采于云南丽江，经机械压榨，提取青刺果油后所得油粕。

芦丁标准样品：国药集团化学试剂有限公司；BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）、VC、磷酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、水杨酸、盐酸均为分析纯：南京化学试剂有限公司；硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、石油醚、无水乙醇为分析纯：汕滇药业有限公司。

1.2 仪器

KH-500TDB型高频数控超声波清洗仪：昆山禾创超声仪器有限公司；A L104型电子天平：梅特勒一托利多化学仪器有限公司；722N型分光光度计：天津冠泽科技有限司；JJ-2组织捣碎机、真空干燥箱：上海恒科公司；RE-2000旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线绘制

以芦丁作为标准品用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法测定黄酮含量。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。如图1所示。线性回归方程为y=11.514x+0.002 1；R2=0.999 6 质量浓度在 0.01mg/mL～0.06mg/mL范围内线性良好。

图1 芦丁标准的标准曲线Fig.1 Standard curve of flavonoids

1.3.2 青刺果总黄酮的超声提取及测定

将青刺果油粕干燥粉碎后过60目筛。称取一定量样品，加入过量的石油醚反复萃取至色素消失，60℃下烘干，备用。然后精确称取该油粕1.000 0 g置于提取瓶中，加入一定量乙醇溶液，在设定温度下超声辅助提取一段时间后过滤，其滤液即提取液。将滤渣再超声提取一次，合并滤液，浓缩后定容，测定吸光度，通过回归方程求出浓度，计算出提取液中总黄酮的质量。按下列公式计算总黄酮的得率：

总黄酮得率/%=提取液中黄酮质量/青刺果油粕质量×100

1.3.3 单因素试验

分别考察超声时间，提取温度，料液比，乙醇浓度对青刺果总黄酮得率的影响。

1.3.4 正交试验

超声辅助提取正交因素水平表见表1。

表1 超声辅助提取正交因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment design

1.3.5 青刺果黄酮体外抗氧化性测定

还原力的测定采用铁氰化钾还原法[13]，羟自由基（·OH）的清除采用水杨酸比色法[14]。超氧自由基（O2-·）的清除采用邻苯三酚自氧化法[15]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声时间对青刺果总黄酮得率的影响

在超声提取温度 40℃，料液比 1∶20（g/mL），乙醇浓度70%的条件下，选取时间范围为10min～35min，考察超声时间对青刺果总黄酮得率的影响。结果如图2所示。

图2 超声时间对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the total flavonoids yield

由图2可知，超声时间在10min～30min时，青刺果总黄酮得率随时间的增加得率逐渐增大。因为提取时间短，乙醇浸提不充分，得到的总黄酮少，随着时间的延长有利于黄酮的提取，但是30min之后得率下降，有可能是因为超声时间过长，黄酮类物质的稳定性变差，导致得率降低，且能耗增加[16]。

2.1.2 料液比对青刺果总黄酮得率的影响

在超声提取温度40℃，时间30min，乙醇浓度70%的条件下。选取料液比范围为1∶10（g/mL）～1∶35（g/mL），探讨其对总黄酮得率的影响。结果见图3。

图3 料液比对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of solid－liquid ratio on the total flavonoids yield

由图3可知，随着溶剂体积的增大，黄酮得率提高。当料液比为1∶25（g/mL）时，青刺果总黄酮得率达到最大，因为当溶剂用量达到一定程度后，黄酮类物质几乎全部溶出，再增加溶剂用量会增加成本和后续浓缩的难度。

2.1.3 超声温度对青刺果总黄酮得率的影响

在料液比为 1 ∶25（g/mL），超声时间 30min，乙醇浓度70%的条件下，选取温度范围为40℃～65℃，考察提取温度对总黄酮提取效果的影响，结果如图4所示。

图4 超声温度对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the total flavonoids yield

由图4可知，在40℃～60℃范围内，随温度升高，青刺果总黄酮明显得率增大，这是因为黄酮类物质的溶解度会随温度升高而提高。当温度超过60℃时，由于黄酮类物质耐热性较差，过高的温度对其结构产生破坏[17]，而导致得率降低。

2.1.4 乙醇浓度对青刺果总黄酮得率的影响

在料液比 1 ∶25（g/mL），超声时间 30min，提取温度60℃，探讨乙醇浓度（体积分数30%～80%）对总黄酮得率的影响，结果见图5。

由图5可知，总黄酮得率随着乙醇浓度（体积分数）的增加先增大后减小，在乙醇浓度为60%时总黄酮得率达到最大。这可能是由于体积分数为60%的乙醇极性与青刺果中黄酮类化合物的极性较为相近，随着乙醇浓度的增加，会使更多的脂溶性杂质被提取出来导致总黄酮得率有所下降。

图5 乙醇浓度对总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on the total flavonoids yield

2.2 正交试验

在单因素试验的基础上，每个因素下选取3个水平，采用L9（33）正交表来研究不同试验条件下总黄酮的得率，确定提取青刺果总黄酮的最佳工艺条件。结果见表2所示。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2可以看出，各因素对黄酮类物质提取的影响由大到小分别为乙醇浓度＞超声时间＞料液比＞提取温度。根据正交试验初步确定青刺果总黄酮超声提取的最佳工艺条件为A3B2C3D2，即料液比1∶30（g/mL），提取温度60℃，超声时间35min，乙醇浓度60%。在最佳提取工艺条件下，重复3次试验，得到青刺果总黄酮得率的平均值为5.28%。

2.3 青刺果黄酮提取物的抗氧化活性

2.3.1 青刺果黄酮还原能力

青刺果黄酮、VC和BHT的还原能力见图6。

由图6可知，青刺果黄酮、VC和BHT的还原能力随质量浓度的升高而增强。在检测的质量浓度范围内，青刺果黄酮还原力均低于VC；在质量浓度低于0.12mg/mL时，青刺果黄酮还原力低于BHT，而质量浓度大于或等于0.12mg/mL，其还原力与BHT相当。

图6 青刺果黄酮、VC和BHT的还原能力Fig.6 Reduction energy of prinsepia utilis royle flavonoids，BHT and VC

2.3.2 青刺果黄酮对·OH自由基清除作用

青刺果黄酮对羟自由基·OH的清除能力见图7。

图7 青刺果黄酮、VC和BHT对·OH清除作用Fig.7 Scavenging effect of prinsepia utilis royle flavonoids，VCand BHT on free radicals·OH

质量浓度在0.4mg/mL～1.4mg/mL之间时，青刺果黄酮、VC和BHT对·OH（羟自由基）具有清除作用，且随着反应体系中浓度的增加，其对羟自由基的清除效果增强。质量浓度相同时，对·OH自由基的清除能力VC最强，青刺果黄酮次之，BHT最弱。

2.3.3 青刺果黄酮对O2-·清除作用

青刺果黄酮对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除能力见图8。

图8 青刺果黄酮、VC和BHT对O2-·清除作用Fig.8 Scavenging effect of prinsepia utilis royle flavonoids，VCand BHT on free radicals O2-·

随着质量浓度的增加，青刺果黄酮、VC和BHT对超氧阴离子的清除能力均有增强的趋势；在同一浓度下，三者对超氧阴离子自由基消除能力大小为：VC＞BHT＞青刺果黄酮。

3 结论

以得率为考察指标，通过单因素和正交试验，确定了超声辅助法提取青刺果总黄酮最佳工艺参数为：料液比1∶30（g/mL），提取温度 60℃，超声时间 35min，乙醇浓度60%。在此条件下，青刺果总黄酮得率为5.28%。以VC和BHT作为对照，考察了青刺果黄酮体外抗氧化活性。结果表明在所测定的质量浓度范围内，青刺果黄酮具有一定的还原能力，且对羟自由基、超氧阴离子自由基有一定清除作用。青刺果黄酮的还原能力明显低于VC，质量浓度≥1.2mg/mL时，其还原能力与BHT相当；浓度相同时，对·OH清除率比BHT的强、弱于VC，对O2-·的清除率弱于VC和BHT。

[1]董丽萍．大理州野生青刺果经济价值及栽培技术初探[J]．林业调查规划,2004(29):287-288

[2]中国药科大学．中药辞海[M]．北京:中国医药科技出版社,1996:552

[3]廖汝丹.民族药青刺尖的化学成分和药理作用研究进展[J].云南中医中药杂志,2014,35(5):87-88

[4]孙惠峰,张济麟,代继玲,等.青刺果总生物碱抗菌活性研究[J].昆明医科大学学报2014,35(10):12-14

[5]詹素琼,袁定胜,李旭廷,等.青刺果总黄酮定性分析及含量测定[J].安徽农业学报,2010,38(28):15580—15582.

[6]吴小兰.青刺果总黄酮的提取工艺及其对糖尿病小鼠降血糖效应的研究[D].雅安:四川农业大学,2008:11-21

[7]马锐,吴胜本.中药黄酮类化合物药理作用及作用机制研究进展[J].西北植物学报,中国药物警戒,2013,10(5):286-290

[8]赵姗姗.药用植物黄酮类化合物生理活性及合成研究进展[J].大家健康,2016,10(10):299

[9]李富华,刘冬,明建.苦荞麸皮黄酮抗氧化及抗肿瘤活性[J].食品科学,2014,35(7):58-63

[10]陈虹霞,王成章.漆树黄酮类化合物研究进展[J].天然产物研究与开发2013(25):1752-1758

[11]刘万里.山奈中黄酮类化合物的超声强化提取及稳定性研究[J].中国调味品,2016,41(10):58-69

[12]Chen F,Sun Y,Zhao G,et al.Optimization of ultrasound-assisted extraction of anthocyanins in red raspberries and identification of anthocyanins in extract using high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J].Ultrasonics Sonochemistry,2007,14(6):767-778

[13]LI D,LI X,DING X．Composition and antioxidative properties of the flavonoid-rich fractions from tartary buckwheat grains[J]．Food sci Biotechnol,2010,19(3):711-716

[14]张艳萍,戴志远．山茱萸提取物不同极性部位体外抗氧化活性研究[J],中国粮油学报,2009,24(3):98-102

[15]韩少华,朱靖博,王妍妍．邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J]．食品科技,2009,207(6):155-157

[16]张然,王晶,朱春花,等．超声波提取苏芡黄酮类化合物工艺[J]．食品科学,2010,31(22):247-250

[17]周丹蓉,郑少泉,蒋际谋．响应面法优化枇杷花总黄酮超声波辅助提取工艺的研究[J]．热带作物学报,2012,33(7):1219-1224

Ultrasonic-assisted Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavoniods from Prinsepia utilis Royle

LIU Zhao-di，LIU Xiang-yi，ZHANG Shui-tao，LIN Zao-qin，LI Yun-xian，XU Juan*
（School of Chemical Engineering，Southwest Forestry University，Kunming 650224，Yunnan，China）

Ultrasonic-assisted extraction process for total flavonoids from Prinsepia utilis Royle oil meal was studied.The influence of flavonoids extraction was discussed by single factor；confirm its suitable extraction condition of flavonoids by orthogonal experiment．The evaluation of antioxidant activity was carried out by reduc－ing power，hydroxyl，superoxide anion scavenging assays in comparison to VCand BHT.The results showed that ethanol concentration 60%，extraction temperature 60℃，extraction time 35min，material-liquid radio 1 ∶30（g/mL），Under this conditions，the yield of total flavonoids from Prinsepia utilis Royle oil meal was 5.28%.Flavonoids from Prinsepia utilis Royle by ultrasonic-assisted extraction technological parameters presented strong antioxidant activity and its antioxidant capacity was equivalent to butylated hydroxyl toluene（BHT），than that of BHT，but lower than that of VC．

Prinsepia utilis Royle；total flavonoids；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant activity

刘招娣，刘祥义，张水滔，等.青刺果总黄酮超声波辅助提取及其抗氧化活性[J].食品研究与开发，2018，39（1）：20-24

LIU Zhaodi，LIU Xiangyi，ZHANG Shuitao，et al.Ultrasonic-assisted Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavoniods from Prinsepia utilis Royle[J].Food Research and Development，2018，39（1）：20-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.005

云南省大学生创新创业训练计划项目（S201710677007）；西南林业大学科技创新项目（C17009）

刘招娣（1996—），女（汉），本科，研究方向：天然产物提取研究。

*通信作者：徐娟（1982—），女，实验师，硕士，研究方向：生物质资源开发及应用。

2017-04-16