超高效液相色谱-串联质谱法快速测定禽蛋中氯霉素、氟苯尼考及其代谢物残留

曾 勇，董文婷，龚 波，周 青，金 灵

(湖北省兽药监察所，武汉 430070)

超高效液相色谱-串联质谱法快速测定禽蛋中氯霉素、氟苯尼考及其代谢物残留

曾 勇，董文婷，龚 波，周 青，金 灵

(湖北省兽药监察所，武汉 430070)

建立了快速测定禽蛋中氯霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。禽蛋用乙腈提取后，正己烷液液萃取除脂，浓缩后超高效液相色谱分离，以乙腈和10%甲醇水为流动相进行梯度洗脱，MRM反应监测模式检测。结果表明在5～200 μg/L的系列浓度范围内均呈良好线性关系，相关系数均大于0.999。氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的检测限为0.5 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg，在2～20 μg/kg添加浓度范围内平均回收率为60%～100%，精密度小于20%。该方法方便快捷、定性准确，适于禽蛋中的氯霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺药物残留检测。

禽蛋；氯霉素类药物；残留；超高效液相色谱-串联质谱

禽蛋是人们日常生活中重要的优质食品，特别是鸡蛋的蛋白质含量高，而且富含胆固醇，具有较高的营养价值。但蛋鸡饲养密度大，多发疾病，在疾病预防和治疗过程中，由于兽医临床不遵守休药期使用，极易造成鸡蛋中的药物残留，这些残留会直接损害消费者的健康，还会导致细菌的耐药性等等。氯霉素类药物属于广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用，氟苯尼考是动物专用抗菌药，其结构和氯霉素相似，在安全性和有效性方面比氯霉素有明显优势，其主要代谢产物为氟苯尼考胺[1]。农业部公告第235号规定氯霉素为禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出，氟苯尼考为产蛋期禁用药物，而我国目前国家检测标准中只涉及水产品、蜂蜜以及动物肌肉组织中氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺单个或两种药物残留检测方法[2-4]，还未建立蛋品中同时检测氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺残留检测方法。本方法拟建立禽蛋中氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺残留量的液相色谱-串联质谱法，以期为禽蛋中氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺药物残留的监控提供灵敏度高、简便快速的检测技术，对兽药残留监控具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源Acquity UPLC-Quattro Premier XE 质谱联用仪，Waters公司；AE260电子天平，Mettler Toledo 公司；冷冻高速离心机，Sigma公司；涡旋混合器；振荡器；氮吹仪。氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺对照品均来自德国DR公司；乙腈为色谱纯；甲醇为色谱纯；正己烷为分析纯；实验用水为Milli-Q高纯水。

1.2 标准溶液配制 精密称取氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺对照品约10 mg置于100 mL容量瓶中，分别用甲醇溶解并稀释定容至刻度，此溶液浓度为100 μg/mL标准储备液。分别准确量取1.00 mL氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的标准储备溶液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀即得1 μg/mL混合工作液。

1.3 样品处理 称取5 g(精确至0.01 g)试样，置于50 mL塑料离心管，加入10 mL乙腈，于涡旋混合器上涡旋1 min，水平振荡5 min，以10000 r/min离心10 min，取上清液转移至另一离心管中，样品残渣再加入10 mL乙腈重复提取一次，合并上清液。提取液用10 mL正己烷涡旋混匀，以10000 r/min离心5 min，弃去上层正己烷，下层再用正己烷重复操作一次，取下层乙腈在40 ℃水浴中氮吹至近干，准确加入1 mL水溶解残渣，涡旋1 min，转入1.5 mL离心管中，以12000 r/min离心5 min，经过0.22 μm滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱测定。

2 UPLC-MS/MS 分析

2.1 超高效液相色谱条件 色谱柱：waters Xbrige C18柱(3.5 μm，2.1 mm×150 mm)；流动相：A：乙腈，B：10%的甲醇水溶液，梯度洗脱：0～3 min，5%A～40%A，3～4 min，40%A～95%A，4～6 min，95%A～5%A，流速0.3 mL/min；进样量10 μL；柱温30 ℃。

2.2 质谱条件 电喷雾离子源 ESI(+)；扫描方式:正离子扫描(氟苯尼考胺)和负离子扫描(氟苯尼考和氯霉素)；毛细管电压：3.0 kv；离子源温度：110 ℃；脱溶剂温度：350 ℃；脱溶剂流量：800 L/h；多反应监测(MRM采集模式)。各种药物的定性离子对、定量离子对和碰撞能量见表1。

2.3 标准曲线 精密量取一定量的氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺混合标准工作液，用空白样品提取液分别配成浓度为5，10，20，50，100，200 μg/L系列基质标准工作溶液，使用时现用现配。每个浓度重复三次，将测得的峰面积与对应浓度拟合，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数(表2)。

2.4 方法的灵敏度、准确度和精密度 采用空白试样中添加目标化合物的方法，经实验得到特征离子色谱峰信噪比大于或等于3的最低浓度为0.5 μg/kg即方法的检测限。信噪比大于或等10的最低浓度为2.0 μg/kg即方法的定量限。空白禽蛋中添加各药物后得到的特征离子质量色谱图如图1所示。

表1 定性离子对、定量离子对和碰撞能量Tab 1 Qualitative ion pair,quantification ion pair and Collision energy

表2 标准曲线方程Tab 2 Standard curve equation

图1 空白鸡蛋中添加2μg/kg氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的特征离子质量色谱图Fig 1 Characteristic ion mass chromatogram of chloramphenicol,florfenicol and florfenicol amine 2μg/kg added in blank eggs

在空白禽蛋中添加2.0、4.0、20.0 μg/kg三个不同浓度的药物进行回收率试验，每个浓度进行5个平行试验，重复进行3次，鸡蛋结果见表3，鸭蛋结果见表4。本方法在2～20 μg/kg浓度范围内，添加浓度的回收率为60%～100%。批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。

表3 鸡蛋中添加药物回收率及精密度测定结果Tab 3 Recovery rate and precision of the drugs added in eggs

表4 鸭蛋中添加药物回收率及精密度测定结果Tab 4 Recovery rate and precision of the drugs added in duck eggs

3 讨论与小结

3.1 提取与净化 氯霉素、氟苯尼考都是弱极性化合物，而氟苯尼考胺属于极性化合物，且它们都属于弱碱性化合物，极易溶于甲醇、乙腈和乙酸乙酯等有机溶剂。国内外关于在动物组织样品中同时提取氯霉素、氟苯尼考以及氟苯尼考胺大多采用碱化乙酸乙酯。本实验比较了乙腈、碱性乙酸乙酯、甲醇三种试剂的回收率情况，甲醇回收率较低，禽蛋中加入碱性乙酸乙酯后样品基质变成果冻状，无法充分提取。用乙腈能有效提取三种药物，再用正己烷去除脂肪等杂质，省去了固相萃取步骤，旋转蒸发，浓缩时用氮气吹干取代，减少了交叉污染的机会。

3.2 流动相条件 试验中发现，乙腈和10%甲醇水作为流动相，各组分均能较好分离，并且峰形较好，在质谱上也有较强的响应。而乙腈和0.1%甲酸水作为流动相时，对于正离子模式采集的氟苯尼考胺的信号有明显增强，因为甲酸对分析物容易质子化而带上正电荷，然而对于氯霉素和氟苯尼考的负离子采集模式会受到抑制[5]。

3.3 基质效应 对氯霉素类物质残留检测文献中采用的是内标法，本文采用了配制基质曲线法外标定量，用基质空白溶液配制标准溶液，从而降低基质效应。在实验过程中也考察了基质效应的影响，采用空白鸡蛋样品按照1.3项的提取方法制得阴性空白基质样液(B)，然后用空白试剂水(A)和空白基质样液(B)，分别配制2.3项的标准曲线系列溶液，得到标准溶液A和标准溶液B，进行测定，标准曲线见表5。基质效应ME可以用基质曲线斜率/标准曲线斜率×100%来进行计算，一般认为基质效应ME在85%～115%之间不存在明显基质效应，从表5可以看出，氯霉素和氟苯尼考两种药物在乙腈提取制得的空白基质样液无明显的基质效应。

表5 氯霉素类化合物标准溶液和基质标准溶液的线性方程和基质效应(ME)Tab 5 Linear equations and matrix effect of chloramphenicol standard solution and matrix standard solution(ME)

3.4 方法的定量限 在方法研究中，氯霉素浓度在0.3 μg/kg时，其S/N为23.6，说明降低氯霉素的定量限空间很大，后续可进一步研究，降低氯霉素的定量限。

本研究建立了禽蛋中氯霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺残留检测的UPLC-MS/MS分析方法，通过对仪器色谱条件和质谱条件各项参数的调谐以及对样品前处理条件的优化，使得方法的灵敏度、精确度均能满足兽药残留分析。本方法具有操作步骤少、有机溶剂消耗少、测定周期短等优点，而且能同时对氯霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺三种药物进行多残留检测。

[1] Horsberg T E,Martinsen B,Vamma K J.The disposition of 14C-Florfenicolin a tlantie salmon(Salmo Salar)[J].Aquaculture,1994,122:97-106.

[2] 刘智宏，黄耀凌，汪 霞，等水产品中甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺酶联免疫多残留测定[J]. 中国兽药杂志，2010,44(12)：1-5.

Liu Zh H, Huang Y L, Wang X,etal. Multi-residues determination of Thiamphenicol、Florfenicol、Florfenicol Amine in aquatic products by ELISA[J].Chinese Journal of Veterinary Drug,2010,44(12):1-5.

[3] 谢恺舟，姚宜林，李洋静，等.高效液相色谱荧光检测法同时检测鸡肉中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留[J].中国兽医学报，2010，30(4)：489-492.

Xie K Zh, Yao Y L, Li Y J,etal. Simultaneous detection of Florfenicol and Florfenicol Amine in poultry meat by HPLC-FD[J].Chinese Journal of Veterinary Science,2010,30(4):489-492.

[4] 刘永涛，艾晓辉，李 荣，等.水产品中氟苯尼考和氟苯尼考胺的高效液相色谱荧光法同时测定[J].分析测试学报，2008，27(3)：316-318.

Liu Y T, Ai X H, Li R,etal. Simultaneous detection of Florfenicol and Florfenicol Amine in aquatic products by HPLC-FD[J].Journal of Instrumental Analysis,2008,27(3):316-318.

[5] 孙 雷，张 骊，王树槐，等.超高效液相色谱一串联质谱法检测动物源食品中氯霉素类药物及其代谢物残留[J].中国兽药杂志，2009，43(3)：42-45.

Sun L, Zhang L,Wang Sh H,etal. A detection of Chloramphenicol and Chloramphenicol metabolites in food by UPLC-MS/MS[J].Chinese Journal of Veterinary Drug,2009,43(3):42-45.

RapidDeterminationofChloramphenicol，FlorfenicolandItsMetabolitesinPoultryEggsbyUPLC-MS/MS

ZENG Yong ,DONG Wen-ting,GONG Bo, ZHOU Qin, JIN Ling

(HubeiInstituteofVeterinaryDrugControl,Wuhan430070，China)

A UPLC-MS/MS method was developed and established to rapidly determine chloramphenicol, florfenicol and florfenicol-amine in poultry eggs. The eggs were extracted with acetonitrile and then separated by n-hexane liquid. After enrichment, the samples were separated by UPLC, elutedwith acetonitrile and 10% methanol as the mobile phase and the MRM reaction was monitored. The results showed that there was a good linearity in the range of 5～200 μg/L ,and the correlation coefficients were more than 0.999. The detection limit of the chloramphenicol, florfenicol and florfenicol-amine was 0.5 μg/kg, and the limit of quantification was 2 μg/kg. The average recoveries were 60%～100% in the range of from 2 μg/kg to 20 μg/kg, and the precision was less than 20%. The method was convenient, rapid, accurate and it was suitable for the detection of chloramphenicol in poultry eggs.

poultry eggs; chloramphenicol; residues; UPLC-MS/MS

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.08

2017-06-20

A

1002-1280 (2017) 12-0042-05

S859.84

曾 勇，农业推广研究员，从事兽药残留分析方法研究工作。E-mail: zengyong633@126.com

(编辑：侯向辉)