来自两个世界的最佳高效的液相色谱分析方法

文/Isabelle Mller

来自两个世界的最佳高效的液相色谱分析方法

将HPLC高效液相色谱操作方法转移至UHPLC超高效液相色谱技术中实现更高效检测。在科学研究及质量控制之间，往往需要交替使用HPLC高效液相色谱峰和UHPLC超高效液相色谱法两种不同的实验分析技术方法。现代化的HPLC实验分析设备和软件工具同样支持实验员在其他系统中采用HPLC法。

图1 以头孢菌类抗生素为例：简单的将HPLC检测分析方法转换到UHPLC时出现的问题

在医药产品、食品生产及其他不同生产领域之中，高效液相色谱技术越来越广泛应用于细胞连接或杂质定性、定量分析。随着实验室工作量增加及实验室工作效率提高，超高效液相色谱分析技术UHPLC同样出现在实验室日常工作中。

这两种实验分析技术区别在于使用的最大系统压力不同，在提高了UHPLC超高效液相色谱系统元器件的高压稳定性后，相似的分离性能下，超高效液相色谱技术所需时间更短。该高端设备首先需要在研究与开发项目中使用，以便能够更快找到新的实验分析方法。在医疗实验分析过程中，超高效液相色谱技术同样得以应用：通过快速的实验分析时间，提高样本检验率和仪器设备利用率。

在许多常规分析领域中则相反，例如，质量监控和质量保证中使用的仍然是普通高效液相色谱技术HPLC；因为它坚固耐用、维护保养成本低。在具有高效和超高效两种液相色谱分析系统实验室中出现两种新情况：一种是将HPLC高效液相色谱技术方法移植到UHPLC超高效液相色谱技术中去，以便提高工作效率；另一种，是将UPHLC超高效液相色谱技术分析方法移植到更加稳定的HPLC高效液相色谱法中。

然而，不同系统之间检测分析技术方法的相互移植不仅是简单缩短分析时间，而且它们的工作参数，例如，液相流动流速、色谱流出曲线和所用色谱柱尺寸必须加以改进。将某一生产厂家生产的液相色谱系统检测分析方法移植到另一生产厂家系统中使用情况类似。如果检测分析方法移植不成功，则可能是洗脱顺序、分辨率和相对保留数据有差异——使检测分析结果没不具可比性（参见图1）。

色谱柱尺寸和实验分析条件

从HPLC切换到UHPLC时最明显的变化是重新选择合适的UHPLC色谱柱。UHPLC色谱柱更短、色谱柱内径更细、分离颗粒物更小，色谱柱尺寸规格合适后仍需注意检测分析时的分离条件。在HPLC高效液相色谱技术中优化了的分析参数在UHPLC超高效液相色谱分析方法中使用受限；同样，在UHPLC超高效液相色谱分析技术中的最佳参数不是HPLC高效液相色谱分析技术中的最佳参数。

不同系统检测分析方法需要注意的参数

液相流动流速；

色谱流出曲线（梯度、进样阀和事件电路）；

系统死体积；

探测器数据采集流速；

注入量；

系统最大压力；

在梯度分析时，必须调整色谱流出曲线。如果仅缩短检测分析时间而没有调整色谱流出曲线，则分离结果会有巨大差异。在规范检测分析环境中常对相对保留时间和洗脱顺序另行规定。因此，在成功检测分析方法移植中必须强制对色谱流出曲线做出调整匹配。

人工手动移植检测分析方法，包括：对所有相关参数进行调整，非常复杂，需要消耗大量时间。为避免这些问题，有些液相色谱系统的生产厂家提供成功的移植检测分析方法时所需的参数换算程序，有些甚至提供了UHPLC系统专用的转换接口。

本刊提示：方法转换

检测分析方法的转换具有很多方面原因，不是转换至UHPLC超高效液相色谱法中来缩短检测分析时间就是转换至HPLC高效液相色谱法中得以保证检测分析结果具有更高的稳定性。两种方法转换至人工手动调整、设置参数非常耗费时间和精力。利用软件工具将现有检测分析方法转换至UHPLC系统中则是一种易于使用操作、节约时间而且参数换算可靠的可替代解决方案。利用专用复合式系统，例如，将UHPLC和HPLC合二为一的Nexera-iMT系统，从而省去两套系统各自独立认证鉴定费用，可以舒适、方便的在HPLC和UHPLC之间进行双向转换。

图2 Lab Solutions软件中的方法转换工具

可靠的双向移植

例如，配用Lab Solutions软件，由Shimadzu公司研发生产的Nexera-i MT色谱系统就是能够实现UHPLC系统转换的综合系统；其配用软件适用于HPLC和UHPLC双向转换时的分析条件换算。该系统具有两套单独的液相流动管道，一套用于HPLC，另一套用于UHPLC，两套液相管道可以无缝彼此进行交换。

通过将HPLC与UHPLC在一台设备中进行组合可以为用户带来诸多便利。首先，两种检测分析方法的转换是在一套检测分析仪上完成，一套设备替代了原来的两套设备。同样减少了实验室的面积占用、减少维护保养工作量。另外，还可以通过不同的配套辅具对系统容量进行匹配，从而可以在不同生产厂家生产的色谱仪之间通过死容积调整匹配的方式实现不同检测分析方法的转换。

图3 头孢类抗生素分析时从HPLC转换到UHPLC时的最佳参数

图4 磺胺类药物分析从UHPLC变换到HPLC时的最佳参数

Lab Solutions软件可以利用系统内置转换工具（参见图2）完成不同UHPLC系统检测分析方法转换时的参数换算。开启目前所用的HPLC或UHPLC检测分析所用方法后，只需输入老的和新的色谱柱尺寸以及希望的流速即可。其他参数由软件自动计算，软件系统计算出来的结果可直接保存到新的检测分析方法之中去，无需人工手动输入新的参数。

检测分析方法转换实例

头孢菌类抗生素的快速分析：头孢菌素是口服或注射给药的β-内酰胺类抗生素。首先利用HPLC高效液相色谱技术分离出11个头孢。在检测分析方法转换工具的帮助下，确定UHPLC超高效液相色谱分析时的参数。图3所示是两种方法得到的色谱图及相应的洗脱分离条件。通过HPLC和UHPLC之间的方法转换，在洗脱图形几乎完全一致的情况下，洗脱时间缩短三倍。利用HPLC高效液相色谱技术分析一份样本时需要65分钟时间，利用UHPLC则只需要17分钟即可完全获得具有可比性的洗脱结果。

磺胺类药物的常规分析：磺胺类药物由合成抗菌素和抗感染药物组成。在检测分析过程中，需要从UHPLC超高效液相色谱法转换至HPLC高效液相色谱法中。运用UHPLC方法生产的磺胺类物质洗脱分离将在方法转换工具软件的帮助下进行换算、确定出新的HPLC洗脱分离所需色谱柱尺寸。图4所示是两种检测分析方法色谱图及相应的检测分析条件。通过改用长度更长的色谱图便能将洗脱分离时间延长到20分钟左右，不再是UHPLC超高效液相色谱洗脱时的5分钟，但得到的分离结果几乎完全一致。

本文作者系杜伊斯堡市Shimadzu德国有限责任公司的工作人员。