不同剂量鳖甲煎丸对大鼠血小板聚集功能影响对照实验研究*

(邯郸 056002)

河北工程大学附属医院神经内科

不同剂量鳖甲煎丸对大鼠血小板聚集功能影响对照实验研究*

邢继军闫纪琳李彤中庞岚△(邯郸 056002)

河北工程大学附属医院神经内科

目的：研究鳖甲煎丸对大鼠血小板聚集功能的影响。方法：将健康SD大鼠随机分4组，空白对照组(生理盐水)、阿司匹林组(阳性对照组)、鳖甲煎丸高、低剂量组(2.0、 1.0 g/kg)。以二磷酸腺苷(ADP)、胶原、凝血酶为诱导剂活化血小板，采用比浊法观察空白对照组及不同药物处理组对血小板聚集率的影响。结果：空白对照组经ADP、胶原、凝血酶为诱导剂活化后其血小板聚集率分别为(45.36±0.43)%、(47.14±0.43)%、(46.86±0.41)%，经阿司匹林药物处理后其血小板聚集率明显下降分别为(28.84±0.21)%、(30.62±0.21)%、(29.85±0.21)%，低剂量鳖甲煎丸作用后血小板聚集率分别为(30.39±0.19)%、(32.08±0.15)%、(31.70±0.17)%，经高剂量鳖甲煎丸作用后血小板聚集率(29.74±0.21)%、(31.52±0.21)%、(30.64±0.21)%，3组与空白对照组相比都能够明显降低血小板聚集率，差异有显著性；以ADP和胶原为诱导剂活化的血小板中，阿司匹林组对血小板聚集抑制率[(36.24±0.01)%、(34.93±0.01)%]明显高于低剂量[(32.79±0.01)%、(31.81±0.01)%]和高剂量鳖甲煎丸处理组[(34.22±0.01)%、(32.99±0.01)%]；在以凝血酶为诱导剂活化的血小板中，阿司匹林组对血小板聚集抑制率(36.19±0.01)%明显高于低剂量鳖甲煎丸处理组(32.21±0.01)%，而与高剂量鳖甲煎丸处理组(34.49±0.01)% 差异无显著性。结论：不同剂量鳖甲煎丸同阿司匹林一样可有效抑制由ADP、胶原、凝血酶诱导的血小板聚集，应用高剂量鳖甲煎丸能够和阿司匹林有相同的血小板抑制效果及祛聚治疗效果。

鳖甲煎丸；血小板聚集；二磷酸腺苷；凝血酶；胶原；对照实验

脑梗塞是好发于中老年人的常见病、多发病，具有高致残率、高死亡率、高复发率的特点，血小板聚集在血栓形成过程中发挥重要作用，因此, 如何防治血小板聚集已成为目前研究脑血管病领域亟待解决的问题之一。

鳖甲煎丸为医圣张仲景所创，由鳖甲、牡丹皮、芍药等药物组成，具有活血化瘀、软坚散结的功效。现代药理研究证实，芍药中成分赤芍对二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集具有明显的抑制作用。[1]而牡丹皮有效组分丹皮酚、芍药苷可有效抑制不同诱导剂活化后血小板的聚集。[2]但是尚未见到有关鳖甲煎丸对血小板聚集影响的实验研究报道。

本研究采用不同诱导剂活化大鼠血小板方法，观察鳖甲煎丸对血小板聚集功能的影响，初步探讨其抗血栓形成的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：健康SD大鼠40只，体质量(300±10) g，雌雄均有，由河北医科大学动物实验中心提供。

1.1.2 药物：鳖甲煎丸由武汉中联药业集团股份有限公司提供。阿司匹林由拜耳医药保健有限公司提供。所有药物用蒸馏水配成所需浓度，供灌胃给药。

1.1.3 试剂： ADP、凝血酶、胶原购自美国Biopool公司。

1.1.4 仪器：血小板聚集及血凝测试仪，北京世帝科学仪器仪器公司 MODEL PAPER-1型。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及给药： 取SD大鼠40只，随机分为4组：空白对照组(生理盐水)、阿司匹林组(30 mg/kg)(阳性对照组)、鳖甲煎丸高剂量组(2.0 g/kg)、鳖甲煎丸低剂量组(1.0 g/kg)。实验开始后，每组动物均连续给药5 h。

1.2.2 血小板血浆的制备: 末次给药5 min后，用4%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，颈总动脉插管取血，加入3.8%枸橼酸钠抗凝，以800 r/min离心10 min，取上层液即得富血小板血浆(PRP)，剩余血液以3 000 r/min离心10 min，取上层液即得贫血小板血浆(PPP)。

1.2.3 指标测定: 用比浊法测定血小板聚集率，用PPP调定PRP使血小板计数为50×1010/ L，分别吸取PPP、PRP各300 μL加入测试杯中，以PPP调0，PRP调100%，PRP在37℃温育5 min后,分别加入ADP、胶原、凝血酶激活血小板，测定5 min内血小板最大聚集率。并按以下公式计算血小板聚集抑制百分率。血小板聚集抑制率=(对照管血小板聚集率-给药管血小板聚集率/对照管血小板聚集率)×100%。

2 实验结果

2.1 不同实验组对经ADP诱导激活后血小板聚集率的影响 经ADP诱导激活后，空白对照组血小板聚集率为(45.36±0.43)%，阳性对照组为(28.84±0.21)%，鳖甲煎丸低剂量组为(30.39±0.19)%，鳖甲煎丸高剂量组为(29.74±0.21)%，与空白对照组比较经ADP诱导激活后阿司匹林及鳖甲煎丸不同剂量组血小板聚集率明显下降(t阿司匹林=34.49P<0.05；t低剂量=33.02P<0.05；t高剂量=32.63P<0.05)；阿司匹林组在血小板聚集率及抑制率上与鳖甲煎丸不同剂量组比较有明显优势。详见表1。

项目空白组阳性组低剂量组高剂量组血小板聚集率(%)45.36±0.4328.84±0.21▲30.39±0.19▲△29.74±0.21▲△抑制率(%)36.24±0.01*32.79±0.01△34.22±0.01△#

注：与空白组比较，▲P<0.05；与阳性组比较，△P<0.05；与低剂量组比较，*P<0.05，#P>0.05

2.2 不同实验组对经胶原诱导激活后血小板聚集率的影响 经胶原诱导激活后，空白对照组血小板聚集率为(47.14±0.43)%，阳性对照组为(30.62±0.21)%，鳖甲煎丸低剂量组为(32.08±0.15)%，鳖甲煎丸高剂量组为(31.52±0.21)%，与空白对照组比较经胶原诱导激活后阿司匹林及鳖甲煎丸不同剂量组血小板聚集率明显下降(t阿司匹林=34.49P<0.05；t低剂量=31.92P<0.05；t高剂量=32.63P<0.05)；阿司匹林组在血小板聚集率及抑制率上与鳖甲煎丸不同剂量组比较有明显优势。详见表2。

项目空白组阳性组低剂量组高剂量组血小板聚集率(%)47.14±0.4330.62±0.21▲32.08±0.15▲△31.52±0.21▲△抑制率(%)34.93±0.01*31.81±0.01△ 32.99±0.01△#

注：与空白组比较，▲P<0.05； 与阳性组比较， △P<0.05；与低剂量组比较，*P<0.05，#P>0.05

2.3 不同实验组对经凝血酶诱导激活后血小板聚集率的影响 经凝血酶诱导激活后，空白对照组血小板聚集率为(46.86±0.41)%，阳性对照组为(29.85±0.21)%，鳖甲煎丸低剂量组为(31.70±0.17)%，鳖甲煎丸高剂量组为(30.64±0.21)%，与空白对照组比较经凝血酶诱导激活后阿司匹林及鳖甲煎丸不同剂量组血小板聚集率明显下降(t阿司匹林=37.52P<0.05；t低剂量=34.74P<0.05；t高剂量=35.52P<0.05)；阿司匹林组在血小板聚集率上与鳖甲煎丸不同剂量组比较有明显优势在对血小板抑制率上高于鳖甲煎丸低剂量组(t=4.37P<0.05)，而与鳖甲煎丸高剂量组比较差异无显著性(t=1.91，P=0.06)。对于经凝血酶诱导激活的血小板，高剂量鳖甲煎丸与阿司匹林有着相同的抑制血小板聚集的效果。详见表3。

项目空白组阳性组低剂量组高剂量组血小板聚集率(%)46.86±0.4129.85±0.21▲31.70±0.17▲△30.64±0.21▲△*抑制率(%)36.19±0.01*32.21±0.01△34.49±0.01△*○

注：与空白组比较，▲P<0.05；与阳性组比较，△P<0.05， ○P>0.05；与低剂量组比较，*P<0.05

3 讨论

血小板具有黏附聚集和释放功能, 并且具有较强的促凝活性, 在血栓形成与止血过程中起着重要作用。血小板过度活化以及凝血系统的激活则易导致血栓形成，反之则有出血的危险。因此血小板和凝血异常是各种出血性和血栓性疾病的病理生理基础。[3]一般情况下血小板处于静息状态，当血管内皮损伤或血液在某些病理生理刺激因子作用下，血小板发生黏附、聚集和释放等活化反应。血小板聚集是指凝血的一个过程，即血小板之间互相黏附形成的一个个血小板团，是指许多血小板黏附在一起的一个状态。血小板的聚集功能是能够对血小板功能、血液凝血状态做出反映的重要指标，具有良好的临床应用价值。[4]现代医学表明血小板聚集功能异常与缺血性脑卒中的发生极为密切，并能预警急性缺血性脑卒中的发生。[5]近年研究也发现心脑血管缺血性疾病患者，体循环中血小板聚集活性显著增高，[6]因此降低血小板的聚集率, 抑制血小板活化将有助于预防血栓的形成, 改善血液的凝聚状态, 对脑血管疾病的防治起重要作用。

阿司匹林是研究最广泛的抗血小板药物，其作用机制为通过抑制血小板花生四烯酸代谢来抑制血小板黏附和聚集。缺血性卒中早期使用阿司匹林，可降低卒中复发的危险性并改善功能转归，[7-8]已取得较高级别的循环医学证据。而鳖甲煎丸为《金匮要略·疟症》篇治疗疟母之主方, 是张仲景制方药物最多的方剂，临床应用已二千 余年，组方严密，配伍科学，具有活血化瘀、 软坚散结的作用。其药物组成分析发现，其中牡丹皮、芍药组份通过不同程度地抑制体外经不同诱导剂活化后的血小板聚集反应，从而发挥降低血小板聚集率的作用。[7]因此，笔者在实验时选取了临床上疗效较好且得到公认的药物阿司匹林作为阳性对照药物，以观察鳖甲煎丸对血小板的聚集作用影响，为临床应用提供理论基础和依据。

本研究结果显示，不同剂量鳖甲煎丸同阿司匹林一样能够有效抑制由ADP、凝血酶、胶原等不同诱导剂活化后的血小板聚集，经不同剂量鳖甲煎丸处理后的血小板聚集率虽高于阿司匹林组，但较空白对照组明显下降。鳖甲煎丸组份中含有牡丹皮、芍药，两者在对影响血小板的聚集发挥了重要作用。研究发现，赤芍总苷能显著延长小鼠和大鼠的凝血时间，具有显著的抗凝、抗血栓形成作用。[9]因此通过使用鳖甲煎丸，可以发挥降低血栓形成和血栓类疾病风险的作用，对预防缺血性脑血管疾病的发生起着重要的辅助治疗作用，为临床研制开发新的防治心脑血管疾病的药物奠定理论基础。通过不同剂量分组结果，对于凝血酶导致的血小板聚集，高剂量鳖甲煎丸组与阿司匹林组的抑制率无明显差异，其血小板聚集率高于阿司匹林组，因此，在临床治疗中使用高剂量鳖甲煎丸是安全的，可以起到较好的治疗效果，同时又能避免临床出现用药过量导致的凝血机制障碍等副反应，从而发挥较好的祛聚作用。

[1] 魏毅, 刘婷婷, 林婷婷, 等. 黄芪多糖及其与白芍总苷协同对兔血小板聚集功能的影响[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2005, 10(8): 932-934

[2] 郭齐, 李连达, 郝伟, 等. 牡丹皮有效组分重组方对家兔血小板聚集及凝血功能的影响[J].中国现代应用药学, 2010, 27(11): 967-970

[3] 费鲜明, 周永川, 祁金文, 等. 木瓜蛋白酶对血小板聚集的抑制作用[J].中国临床药理学与治疗学, 2009, 14(8):906-911

[4] Arima H,Chalmers J,Wordward M, et al, Lower tavget blood pressures are effective for the prevention of recurrent stroke: the progress trial[J]. J Hypertens, 2006, 24(7): 1 201

[5] 刘超, 李成山, 李妍怡. 中风膏对缺血性脑卒中患者血小板聚集率的影响[J]. 西部中医药, 2013, 26(12):5-7

[6] 张予阳, 孙文静, 张毓芬, 等. 4-氯-7-羟基黄酮衍生物对家兔血小板聚集的影响[J]. 中国药理学通报, 2000, 16(1):230-231

[7] 刘玥, 殷惠军, 史大卓, 等. 活血化瘀中药与抗血小板治疗[J]. 科学通报, 2014, 59(8): 647-655

[8] 饶明利. 中国脑血管防治指南[M]. 北京. 人民卫生出版社， 2006，30-89

[9] 韩景辉,杨海燕. 鳖甲煎丸抗动脉粥样硬化作用研究进展[J].中医学院, 2011, 152 (26): 126-128

R285.5

A

1007-5615(2017)06-0039-03

* 河北省邯郸市科技局资助项目：No.1123108078-11

Δ 邯郸市妇幼医院(邯郸056002)

(2017-10-16 收稿)