金线莲活性成分和分子鉴定的研究进展

梅 瑜，邱道寿

(1.广东省农业科学院作物研究所，广东广州 510640；2.湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙 410128)

金线莲[Anoectochilussp.(Wall.)Lindl]，别名金线兰、金线虎头蕉、金线入骨消等[1-2]，系兰科开唇兰属多年生草本植物，主要分布于中国、日本、斯里兰卡、印度和尼泊尔等国[3]，在中国野生种质资源主要分布在广东、广西、云南、福建、台湾等地区[4-5]。金线莲全草入药，具有清热凉血、消炎解毒、止血降压、强心利尿、调血养颜、扶正固本、养寿延年的功效，享有“药中之王”的美誉，是珍稀名贵的中药材。现代医学表明，金线莲对癌症、糖尿病、高血压、心脏病、妇科疾病、小儿发育以及蛇毒咬伤等有很好的疗效。目前金线莲可用于临床上治疗高尿酸血症[6]、病毒性肝炎[7]、2型糖尿病[8]等，还常用于镇痛、抗炎[9]。由于其株型小巧、叶形优美、叶脉金黄且呈网状排列，也是室内观叶植物的珍品[5，10-12]。笔者就金线莲的生物学特性、化学成分及生理活性、分子鉴定、组织培养和人工栽培等研究现状进行综述，以期为进一步研究和开发利用金线莲提供参考依据。

1 生物学特性

金线莲株高4～18 cm，根状茎匍匐生长，根茎细软，茎节明显；叶互生，卵形或圆卵形，叶片具有金属光泽，叶脉金黄，上表面为暗天鹅绒绿色，下表面为淡紫红色；顶生总状花序，1～6朵疏散的花，花苞淡红色，花瓣黄色或黄白色；结棕色蒴果，窄椭圆形，种子细小、褐色粉末状[5，13-14]。

2 化学成分及生理活性

作为传统草药，金线莲在我国民间具有悠久的应用历史，药效显著，被誉为“药王”。现代研究表明，金线莲含有丰富的多糖[15]、生物碱[16]、甾体及其衍生物、黄酮类化合物[17]、强心苷类、挥发油、氨基酸、微量元素、有机酸等成分，有学者指出金线莲所含的微量元素和氨基酸均高于国产西洋参和野生参[18]，且不同基原、不同栽培条件对金线莲的化学成分有一定的影响[19]。

2.1多糖多糖是金线莲中重要的活性成分之一，据文献报道，中草药里的多糖具有提高机体免疫力的作用，而且金线莲多糖有多种生物活性，具有很高的开发价值。目前对金线莲多糖的研究主要集中在多糖组分、生理功能和提取工艺等方面。

2.1.1组分。金线莲含有丰富的多糖类物质，据报道其多糖由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖等单糖组成[20]。有研究表明，不同基源的金线莲多糖组分不同，滇越金线莲的多糖由甘露糖、葡萄糖、葡糖醛酸、半乳糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖6种单糖组成；台湾银线兰的多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和半乳糖醛酸等单糖组成[21]。

2.1.2生理功能。研究表明，金线莲多糖具有抗氧化[22]、免疫调节[23-24]、抗肿瘤[15]、降血糖和保肝护肝[25-26]等功效。

2.1.2提取工艺。多糖是金线莲重要的药效成分，金线莲多糖的提取工艺对正确评价金线莲的药用价值和品质尤为重要，迄今报道的提取方法涉及水提法[27-28]、稀碱法[29]、超声波提取法[30]。曾碧玉等[31]在单因素试验基础上进行四因素三水平的正交试验对热水浸提法工艺进行优化，认为影响金线莲多糖提取的主次因素依次是提取温度、提取次数、提取时间、料液比，从而得出最优提取工艺条件为：0.5 g金线莲干粉在料液比1∶30、70 ℃水浴、提取时间90 min、提取4次。潘晓丽等[30]应用超声提取法，在单因素试验基础上选择对金线莲多糖提取率影响较大的3个因素(提取功率、料液比、提取时间)进行三因素三水平的正交试验，结果显示金线莲多糖超声提取的的最佳工艺条件是：提取功率为 400 W，料液比为1∶20，提取时间为20 min。

2.2黄酮类黄酮类化合物分子中的酮式羰基能与强酸成盐，其羟基衍生物多呈黄色，在植物体内通常与糖结合成苷类。难溶或不溶于水，能溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂[32-33]。黄酮类具有多种生物活性，主要成分为槲皮素、鼠李素、山奈酚的衍生物，大多具有抗氧化自由基作用。生物类黄酮对心脑血管疾病有治疗和保护作用，还具有降血压、降血脂、抗菌、抗肿瘤、抗氧化自由基、提高机体免疫力、镇咳、镇痛等药理活性[34-35]。

目前对金线莲总黄酮含量的测定主要采用荧光分光光度法[36-37]、紫外分光光度法[38-42]、高效液相色谱法(HPLC)[43]和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)[44]。随着金线莲黄酮类提取工艺[45-47]、含量测定及指纹图谱建立等方面的研究深入，黄酮类化合物成分和结构也被鉴定出来，其中研究最多的是芦丁、槲皮素和异鼠李素等。关璟等[48]、何春年等[49-50]等用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿从金线莲中萃取出不同结构的槲皮素、异鼠李素的多个组分。牟洋等[43]、曹扬远等[44-51]利用色谱技术分离得到了芦丁、异鼠李素、山奈酚、槲皮素等黄酮类化合物并测定了4种黄酮苷元的含量，利用逆流色谱技术得到了金线莲中纯度为96.5%的槲皮素的纯品。关璟等[48]研究发现金线莲中含有的黄酮苷quercetin-7-O-β-D-〔6-O-(trans-feruloyl)〕-glucoside 对 DPPH 自由基有很强的清除作用。

2.3生物碱生物碱是中草药中重要的有效成分之一，有显著的生物活性。台湾大学陈春雄教授首次在金线莲中提取出异亮石松碱(isoselagine)[52]，曾健等[53]与Shyur等[54]认为异亮石松碱(isoselagine)是金线莲中生物碱的主要成分，并且动物试验研究表明异亮石松碱具有强烈的镇痛作用，比吗啡强10～40倍，但伴有“震颤”毒性，无法应用于临床，若能改变其生物碱的部分结构，可使之成为有用的镇痛剂。朱善岚[55]利用液质联用技术，首次在金线莲中发现了石杉碱甲和乌头碱，并测定了其含量，认为石杉碱甲与异亮石松碱(isoselagine)骨架相似，为金线莲在抗阿尔茨海默病方面研究及在临床镇痛方面的利用提供了理论依据。

不同溶剂、不同提取方法对生物碱的提取率也有较大的影响。林丽清等[16]以盐酸麻黄碱为对照品，对金线莲总生物碱的提取方法及条件进行优化，研究发现以氯仿为溶剂提取获得的总生物碱含量较高(0.058 9%)；钟添华等[56]对金线莲总生物碱提取方法和测定方法进行研究，结果显示，以氯仿∶甲醇(V/V2∶1)为溶剂可提取获得金线莲总生物碱含量0.079 5%。

不同培养条件对生物碱含量也有影响。杨翠芹等[57]探讨了不同培养条件对金线莲组培苗总生物碱含量的影响，结果表明，总生物碱随蔗糖浓度的升高而降低，1%蔗糖浓度有利于生物碱积累，总生物碱随继代天数增加呈现先降后升又降的规律，以50 d达到最高。

2.4挥发油张海等[58]利用索氏提取法和气质联用技术(GC-MS)分析鉴定出金线莲挥发油的主要化学成分为叶绿醇(32.823%)、油酸(28.759%)、植物醇(5.271%)、油酸酰胺(4.797%)、反式角鲨烯(3.484%)、植酮(2.787%)和2-单棕榈酸甘油(1.789%)等，占挥发油总量的86.3%。柯伙钊等[59]利用水蒸气蒸馏提取法和气质联用技术(GC-MS)测定了台湾组培金线莲中挥发油成分，乙醚萃取的挥发油中主要成分为烷烃类化合物，占挥发油的86.131%，其次是脂肪酸(3.375%)、酮类(2.476%)、醇类(2.230%)、酚类(2.113%)；正己烷萃取的挥发油主要成分为烷烃类(25.226%)、酚类(23.879%)、脂肪酸(21.348%)、酯类(20.281%)化合物，如2-甲氧基-3-烯丙基苯酚、亚油酸、棕榈酸和亚麻酸甲酯等。陈文娟等[60]对野生金线莲挥发油化学成分进行提取和分析，结果显示，乙醚萃取的挥发油主要成分为亚油酸(20.570%)、1-辛烯-3-醇(18.460%)、棕榈酸(17.616%)和亚麻酸(4.849%)。正己烷萃取的挥发油主要成分为1-辛烯-3-醇(22.385%)、棕榈酸(19.573%)、亚油酸(16.725%)和亚麻酸(4.488%)。另有文献报道，海南栽培金线莲中挥发油的主要成分为正十六烷酸(25.22%)、(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸(15.35%)、(Z，Z，Z)-9，12，15-十八碳三烯酸甲酯(13.64%)、(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸甲酯(6.47%)[61]；福建组培金线莲中的挥发油主要成分为十六羧酸甲酯(47.98%)、棕榈酸(20.57%)、亚油酸(6.17%)和2-十二酮(3.73%)[62]。而且，有研究表明，金线莲挥发油能够抑制人肺癌细胞NCI-H446的增殖[63]。

2.5甾醇类甾醇是以环戊烷多氢菲为骨架的天然醇类化合物，具有消炎、降低胆固醇的作用。金线莲中发现的甾醇类有羊毛甾醇[64]、5α，8α-过氧麦甾-22-烯-3β-醇[65]、麦角甾醇[66]、β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、24-异丙烯基胆甾醇、开唇兰甾醇[67]等。

2.6微量元素和氨基酸据文献报道，金线莲含有人体所需的微量元素和氨基酸。赖应辉等[68]在金线莲中测得微量元素及含量分别为磷2.796 mg/g、钾17.745 mg/g、钙5.146 mg/g、硫1.893 mg/g、镁2.186 mg/g、钠0.254 mg/g、铁3.078 mg/g、锰321.6 μg/g、锌56.99 μg/g、铜13.15 μg/g、钴3.357 μg/g、钼5.951 μg/g、铬10.24 μg/g。王振登等[18]测得的金线莲干品中微量元素含量分别为钙5.56 mg/g、镁2.66 mg/g、锌75.5 μg/g、铁8.49 mg/g、铜17.4 μg/g、锰554 μg/g、钼13.3 μg/g、铬12.3 μg/g、钴3.4 μg/g、硒0.36 μg/g，并测得18种氨基酸，氨基酸总量达8.74%，其中人体8种必须氨基酸含量占3.45%，金线莲所含的微量元素和氨基酸均高于国产西洋参和野生参。

2.7三萜类目前从金线莲中分离得到的三萜类成分有齐墩果酸、熊果酸[69-70]、α-香树脂醇、β-香树脂醇[71]、木栓酮、Sorghumol[67]、表木栓醇[72]等。其中，齐墩果酸是我国首次从该植物中发现[73]，是临床用于治疗急性黄疸性肝炎和慢性肝炎且不良反应较少的药物[74]。

2.8其他金线莲中还含有一些简单的化合物和苷元，吴萍萍[75]测得金线莲药材中含有天麻素和天麻苷元及药理活性成分胞苷、鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤等4种核苷类物质。徐静[71]研究发现金线莲含有(s)-3-羟基-γ-丁内酯、(s)-3-0-对羟基苄基-γ-丁内酯、对羟基苯甲酸、地羟基苯甲醇、十六烷酸-2，3-二羟基丙酯。另有学者研究发现，金线莲含有3-甲氧基-对羟基苯甲醛[64]、邻苯二酚[76]、十八烷[65]、烟酰胺[77]、邻苯二甲酸二丁酯[72]、3-吡啶甲醇[78]等化合物。

3 分子鉴定

金线莲在分子鉴定方面的研究主要是利用分子标记技术进行种质资源鉴定和遗传多样性分析。胡珊梅等[79]采用RAPD技术对福建金线莲(花叶开唇兰Anoectochilusroxburghii)、广西金线莲(滇越金线莲Anoectochiluschapaensis)、台湾金线莲(Anoectochilusformosanus)进行了鉴定，筛选出3个高特异性引物，并揭示了同种不同产地植物的遗传变异。张铁等[80]对文山地区野生的滇越金线莲和3种不同产地的花叶开唇兰进行了RAPD指纹鉴别，共得到108个RAPD标记和95个多态性位点，多肽百分比为87.96%，说明4种材料遗传差异性较大，且3种叶面特征不同的花叶开唇兰可能已经形成新的变形和变种，可通过扩增出的特异性谱带来鉴别。黄颖桢等[81]应用ISSR方法首次对24份金线莲资源进行了遗传多样性研究，能够鉴别出台湾金线莲、福建野生金线莲和大叶种种质资源，与形态和地理分布差异较大的福建金线莲具有相近的遗传关系。

顾慧芬等[82]采用RAPD技术，对金线莲组培苗及野生药材进行了基因组DNA多态性分析，从中筛选出能够用于鉴定金线莲的特异性引物。Lv等[83]利用3个DNA条形码(ITS2、psbA-trnH、matK)序列对福建金线莲及其混伪品进行序列多态性分析，通过构建系统发育进化树确定遗传距离，结果显示，matK扩增成功率较低、psbA-trnH缺少变异位点，只有ITS2序列能够较大地区别金线莲和它的混伪品；通过对ITS2二级结构分析可以看出，金线莲和其混伪品主要区别在于第Ⅰ、Ⅲ螺旋结构的不同。

据文献报道，福建民间习惯把叶面具有金黄色网纹的金线莲称为金线莲母(金线莲)，把网纹不明显或无脉的金线莲称为金线莲公(无线金线莲)，两者以伴生的形式生长在同一环境下[84]。有学者把无线金线莲作为一个新品种分离出来[85]，但后来经鉴定二者为同种植物。另有学者对无线金线莲做了解剖和理化鉴别，也认为二者为同种植物[86]。为了搞清楚二者之间的遗传关系，胡珊梅等[84]采集了同一生态环境下的金线莲和无线金线莲，用RAPD技术做DNA指纹鉴定，结果显示，二者具有部分共同的谱带，但又有各自的特征性谱带，说明二者的遗传基因已产生变异，建议独立成种。

姜福星等[87]采用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术，首次对台湾金线莲全草进行转录组分析，获得Unigene 173 513条，平均长度为680 pb；经Blast比对分析，58 451条得到Nr功能注释，21 386条得到COG功能分析，45 812条得到GO功能解释；经KEGG代谢途径分析，发现130条Unigene与黄酮类物质有关，114条Unigene与萜类化合物有关；并搜索发现21 195个微卫星位点，其中单核苷酸最多，有13 126个，占61.93%。

野生环境下的金线莲能与内生真菌形成菌根共生关系，近年来有不少学者研究内生真菌对金线莲生长发育的影响，研究他们的相互作用，结果发现，内生真菌对金线莲生长发育的确有促进作用[88]，因此引起了学者对共生期间金线莲基因差异表达研究的关注。陈倩倩等[89]利用宏基因组技术，对野生金线莲根部分离富集的内生菌进行混合内生菌的DNA提取和纯化，通过PCR克隆16S rDNA片段并测序，根据序列信息对内生菌群落进行分析，结果显示，金线莲根部主要内生菌包括不可培养细菌、不可培养堆肥细菌、肠杆菌科、类芽孢杆菌属、芽孢杆菌属和短芽孢杆菌属的微生物。朱丹等[90]对野生金线莲根内菌根真菌的基因组DNA进行了提取，并通过PCR扩增技术对ITS片段进行克隆、测序，结果将A12菌株、5号菌株、2号菌株、6号菌株、A46菌株和A55菌株鉴定为丝核菌Rhizoctoniasp.，其有性态为Thanatephorussp.或Ceratobasidiumsp.。江绮晴等[91]从38株野生金线莲中分离获得29株菌根真菌，根据培养特征及菌丝形态差异，将相同种类合并，共获得纯化的菌根真菌15种，其中丝核菌Rhizoctoniasp. 7种；将丝核菌经过番红O-KOH细胞核染色后，结果显示J1、F1、F7为双核丝核菌，G1、G3、G5、G6为多核丝核菌；通过对丝核菌ITS片段PCR扩增、测序及比对分析，初步推断多核丝核菌G1、G3、G5、G6为兰科丝核菌类的念珠菌根菌。李标等[92]从福建金线莲(Anoectochilussp.)根中分离出内生菌AR-18，采用差异显示PCR方法和反式Northern点杂交法，对福建金线莲与之共生的菌根真菌进行差异表达基因的筛选，首次报道了福建金线莲与之内生真菌AR-18共生下编码尿磷酸核苷转移酶基因(UPRTs)和编码突变酶K(matK)基因与菌根真菌互作的功能。

4 组织培养

金线莲种子细小，不具胚乳，只有与真菌共生条件下才能萌发，自然条件下种子的萌发率低，而且生长缓慢，再加上过度采挖，导致野生资源种类濒临灭绝。因此，组织培养技术对金线莲种质资源扩繁、保存以及扩大药源具有重要意义。

金线莲主要以种子、茎尖为外植体，通过无菌播种形成不定芽或丛生芽、分化幼苗、生根壮苗等过程来实现种苗的工厂化生产。近年来，金线莲组织培养研究主要内容包括外植体的选择、培养基的选择、添加激素的种类及比例、添加物的搭配等。外植体的选择主要是对茎段、茎尖、种子等部位的探讨。大多研究者认为茎段形成的愈伤组织在增殖过程中变异少或无变异，能够很好地保持原植株的特性，因此，金线莲快繁一般采用丛生芽扩繁技术[93]。培养基的配制是在MS或1/2MS培养基的基础上添加不同配比的激素，或搭配添加一定的马铃薯泥、香蕉泥、椰汁、苹果、活性炭等，以达到促进其生长量的积累和获得较好的生根效果。

组培光照强度研究方面，2 000～3 000 lx光强下生长旺盛，茎径和叶面积符合商品质量标准；光照强度大于4 000 lx，叶片较大、苗较矮壮，但茎的伸长生长受到抑制[94]。

5 人工栽培

目前，常见的金线莲人工栽培模式可分为大棚栽培和林下栽培2种。大棚栽培分为简易大棚栽培和现代化大棚栽培，林下栽培根据栽培方式分为林下小拱棚栽培、林下床式栽培、林下育苗盘栽培等种类。大棚栽培的优点是便于操作与种植、栽培密度大、产量高；缺点是投入大、成本较高，病虫害易发生且易传播，不适宜在普通农户中推广。林下栽培充分利用树枝遮阳，减少生产投入，与大棚栽培相比，其栽培成本较低，但对林下植被破坏较大，尤其是林下小拱棚栽培和林下梯田种植，不利于水土保持和生态环境保护[95]。

金线莲的栽培基质一般用树皮、刨花、花生壳、草炭、蛭石、腐殖土等。主要病害有茎腐病、猝倒病；虫害有红蜘蛛、蜗牛、鼻涕虫和螨类等，红蜘蛛会造成植株枯死，鼻涕虫和蜗牛能在很短时间内将金线莲叶片吃光。

6 总结与展望

金线莲是我国珍稀的药用植物，保健功能和药理药效显著。随着金线莲组培、栽培技术的日益成熟，一定程度上保护了野生资源，同时保障了金线莲药材原料的市场供应。但目前对金线莲化学成分分析、药理活性、临床应用、细胞学和分子生物学等研究的广度和深度仍不够，特别是对化学成分和药理活性的作用机制研究不够深入，限制了金线莲在临床上的开发与应用。另外，对金线莲细胞学和分子生物学的研究较少，研究仅限于种质资源鉴定和遗传多样性分析，未见蛋白组学和代谢组学的研究报道。

因此，无论在金线莲功能成分和药理活性研究方面，还是在其基因组学研究方面，都有很大的开发研究空间。若将这几方面研究融会贯通，将会更好地促进其药物开发和临床应用研究。

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