流式细胞术在医学检验专业实习教学中的应用

郑美娟

流式细胞术(Flow cytometer，FCM)是利用流式细胞仪对细胞或微粒进行定量分析及分选的一门生物技术，广泛应用于医学及其他学科。目前，流式细胞术在临床医学领域已涵盖免疫学、血液学及肿瘤学等多个学科[1～3]，并成为临床检验医学领域中不可替代的重要诊断技术，其在疾病的诊断、疗效监测及预后判断中均具有重要价值。

医学检验是一门理论与实践密切相联的学科，实习教学是本专业的重要教学阶段。医学检验专业尚没有开设流式细胞课程，但是医学检验的毕业生无论进入临床还是从事科研，都需要掌握流式细胞术的实验技能，因此实习教学中补充流式细胞的相关知识显得尤为重要。本文就医学检验专业实习教学中穿插流式细胞术的工作原理、检测技术、开展的临床项目、实验操作及质量控制等内容进行初步探讨。

1 流式细胞术理论讲述

为了让医学检验专业的学生更好的掌握流式细胞术，首先要让他们了解其检测原理。流式细胞术是集激光技术、电子技术、计算机技术以及免疫学技术为一体的一门新实验技术，它利用一定的压力把单细胞混悬液压入流动室，使两侧鞘液以一定的角度喷出并包裹单细胞悬液通过激光照射的区域，FCM通过收集待测细胞标记的荧光信号和光学信号，进而对待测细胞进行定性以及定量的分析。在实习教学中，为了进一步加深同学们理解流式细胞术的检测原理，我们利用多媒体教学手段向同学讲解，制作形象动画形式讲解流式细胞的原理及流式细胞仪结构，并向同学们介绍相关的流式细胞书籍以及文献资料。

2 流式细胞检测技术介绍

在给同学们详细讲述流式细胞术检测原理的基础上，接下来我们引入FCM的检测技术进行介绍。目前科研及临床涉及的技术主要包括表型分析技术、定量检测技术、可溶性蛋白检测技术以及细胞分选技术。FCM进行表型分析主要是依据细胞表面或内部的特异表达抗原，并应用荧光标记的单克隆抗体分析目的细胞的特征。而定量检测技术是通过流式细胞仪获得精确、可重复的绝对值计数，利用绝对值计数管定量待测淋巴细胞的绝对数目，例如HIV患者可计数CD4+T淋巴细胞绝对数目[4]。可溶性蛋白检测技术是近年发展起来的流式细胞术微球阵列法(Cytometric bead array，CBA)，可用较少的标本量检测多种细胞因子，已广泛利用CBA技术检测多种细胞因子，例如Th1、Th2及Th17类细胞因子及其他细胞因子[5]。细胞分选技术是指流式细胞仪根据分析细胞的特性并能够特异分选某一细胞亚群[6]。分选型流式除了分选特定细胞亚群，也可用于分选病毒[2]。

3 流式细胞术在临床中开展的项目

流式细胞术从基础科学研究逐步扩展到多个领域，主要涉及肿瘤、血液系统疾病以及免疫相关疾病等，尤其在血液系统疾病的诊疗中具有重要作用[7]。目前，流式细胞开展的临床项目除了可以检测各类细胞，亦可以检测血小板、病原微生物及人工合成微球等。其检测的具体内容包括细胞膜、细胞核和胞质中各种抗原分子的定性和定量分析、核酸（DNA和RNA）定量分析以及细菌耐药等方面的分析。我们于2011年和2017年分别引入BD FACS CaliburTM以及BD FACS CantoTM 流式细胞仪，利用流式细胞仪已开展临床检测项目有白血病免疫分型、淋巴瘤、微小残留、淋巴细胞亚群、绝对计数、HLA-B27、细胞凋亡、细胞周期、血小板自身抗体、封闭抗体、调节性T细胞及细胞因子等项目的检测。针对一些临床开展的项目，我们选择检验科流式细胞实验室收集的典型病历的流式诊断报告给学生进行病例分析。

4 流式细胞术的实验操作

结合医学检验专业的情况，我们采用理论联系实际的办法，为学生设计了我们检验科利用流式细胞术开展的临床项目的实验。通过给学生设计流式细胞技术的实验训练，可促进同学们理解流式细胞术的检测原理以及实验中的注意事项。最重要的是流式技术训练可让学生熟练掌握这门技术，比如上机检测中如何进行流式参数的设置、检测结果的处理分析以及检验报告的发布等，从而提高医学检验学生在日后工作中进行流式细胞检测的能力。除了要求医学检验学生掌握临床项目的检测及分析技能，我们还在学生的实践练习中引入流式细胞技术相关的科研内容。通过向同学们讲述流式细胞技术在科研中的应用，我们鼓励学生在感兴趣课题中引入流式细胞技术，帮助同学们进行流式相关的实验探索和设计，培养学生的科研思维。我们给学生培训的流式细胞技能包括淋巴细胞亚群分析及定量检测、HLA-B27检测以及调节性T细胞检测等。如，让学生动手进行淋巴细胞亚群检测：首先是标本采集，使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2 mL；然后进行细胞染色，流式管中加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP-Cy5.5/CD4-APC抗体，再加入全血100L，混匀后置室温避光孵育15min；加入FACSLysing溶血液2.0 mL，置室温避光孵育10 min；300 g离心5 min，弃上清液；PBS洗涤细胞2次，300 g离心5 min，弃上清液；300L PBS重悬上机检测；流式软件分析结果并准备流式检测报告。

5 流式细胞术的质量控制

流式细胞实验的质量控制也尤为重要。FCM的质量要求是使检测报告最真实的反应患者的患病情况或者无病状态，这同时也是实验室能对临床要求最大的满足。因此有必要让同学们了解流式细胞的质量控制。研究表明流式实验中采用稳定的已知质控物，可保证免疫表型检测的结果可靠[8～9]。我们进行流式实验检测前，分别用Flow-Check微球以及Flow-Set荧光微球校准流式细胞仪的光路与流路、光电倍增管。为了控制实验的精密度，使用全血质控品或质控品干粉进行室内质量控制。此外，作为室内质量控制的补充，我们积极参加卫生部临检中心每年举办的室间质量评价，以控制流式实验室工作的准确度。

6 结 语

随着流式细胞仪的性能日臻完善，流式细胞技术在科研以及临床诊断中的重要价值愈发凸显，因而医学检验专业的同学有必要得到流式细胞新技术的锤炼。我们选择医学检验专业实习期的同学，在实习过程中进行流式细胞技术的相关教学，使学生掌握这门新技术并能够分析流式细胞检测报告，同时帮助学生拓展科研思路，促使流式细胞技术平台更深入的应用于科研和临床工作，有效推进科研人才的培养和临床工作人员技能的提高。

参考文献

[1] Mejia-Ariza R, Rosselli J, Breukers C, et al.DNA Detection by Flow Cytometry using PNAModified Metal-Organic Framework Particles.Chemistry, 2017, 23(17): 4180～4186.

[2] Khalil JY, Langlois T, Andreani J, et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Front Cell Infect Microbiol, 2016, 6(1): 202.

[3] Hirche C, Frenz T, Haas SF, et al. Systemic Virus Infections Differentially Modulate Cell Cycle State and Functionality of Long-Term Hematopoietic Stem Cells In Vivo. Cell reports, 2017, 19(11): 2345～2356.

[4] Angira F, Akoth B, Omolo P, et al. Clinical Evaluation of the BD FACSPresto Near-Patient CD4 Counter in Kenya. PloS one, 2016, 11(8): e0157939.

[5] Ma L, Zhang H, Hu K, et al. The imbalance between Tregs, Th17 cells and inflammatory cytokines among renal transplant recipients. BMC immunology,2015, 16(9): 56.

[6] Cabanelas IT, van der Zwart M, Kleinegris DM,et al. Sorting cells of the microalga Chlorococcum littorale with increased triacylglycerol productivity.Biotechnology for biofuels, 2016, 9(1):183.

[7] 王兴兵,刘欣,薛磊,等.血液科临床医师流式细胞术专科诊断能力的培养[J].安徽卫生职业技术学院学报,2017,16(2):113～114.

[8] Finak G, Langweiler M, Jaimes M, et al.Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Scientific reports, 2016,6.

[9] 吴丽娟,陈伟.《流式细胞术及其临床应用》选修课探索[J].中国高等医学教育,2006(3):51～53.