中国新疆部分地区马泰勒虫感染的差异性及系统发育分析

(1.新疆农业大学动物医学学院， 830052；2.和静畜牧兽医站，新疆和静 841300；3.昭苏县畜牧兽医站，新疆昭苏 835604)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2017.11.021

中国新疆部分地区马泰勒虫感染的差异性及系统发育分析

刘世芳1，郭庆勇1，闻秀秀1，张梦园1，党娜娜2，阿拉西·阿滨3，巴音查汗1

(1.新疆农业大学动物医学学院， 830052；2.和静畜牧兽医站，新疆和静 841300；3.昭苏县畜牧兽医站，新疆昭苏 835604)

目的分析新疆南北疆马泰勒虫感染的差异性及地方流行株遗传进化距离，研究马泰勒虫遗传多样性及其感染率。方法采自南北疆478份疑似马匹的血样，经马泰勒虫PCR方法检测，分析马泰勒虫感染情况并应用最大似然法(ML)基于18 S rRNA基因的遗传进化树及构建系统发育树。结果在所采集的样品中，中国新疆北疆地区马泰勒虫感染阳性率为13.96%(25/179)，中国新疆南疆地区马泰勒虫感染阳性率为27.09%(78/299)。印度、南非、西班牙、伊朗等地方株聚为一支，扩增的18S rRNA基因(MF398476、MF398477)与瑞典地方株聚为一支。结论中国新疆南疆马泰勒虫感染率高于北疆，南北疆马泰勒虫感染存在显著性差异(P=0.001<0.05)，在不同年龄段马匹的感染无显著性差异(P>0.05)；扩增的马泰勒虫阿勒泰、托克逊地方流行株(MF398477、MF398476)与瑞士地方株(KM046918.1)亲缘关系最近。

马泰勒虫；感染；系统发育

0 引 言

【研究意义】马泰勒虫是由硬蜱传播的顶复门血液内寄生虫，主要寄生于马、骡、驴和斑马等动物的网状内皮系统及红细胞内[1]。引起马临床呈现稽留热、贫血、出血、黄染、呼吸困难等症状[2-4]， OIE将其列为B类疫病，我国将其列为二类疫病[5]。【前人研究进展】马泰勒虫病呈世界性分布，据世界动物卫生组织(OIE)报道，仅2011年全世界27个国家已有马泰勒虫病的流行[6-7]。据报道，全球约90%的马属动物分布在马泰勒虫病流行地区[8-9]，急性病例死亡率可达10%以上[10]，严重影响马匹健康。该病在中国普遍流行，在中国新疆的流行区域主要集中在伊犁、阿勒泰和巴音郭楞州等[11]。多年来马泰勒虫在归类上一直存在分歧[12-13]。1998年根据其在硬蜱体内的发育周期和在宿主马体内的淋巴细胞发育阶段与其他泰勒虫种具有高度的遗传相似性，而将其归类为泰勒属[14]。【本研究切入点】对新疆地区的马泰勒虫感染实验室已积累多年相关资料，基于对南北疆的马泰勒虫的感染没有相关对比分析，对其感染作出相关对比分析，同时近年来的研究发现，其系统发育介于泰勒虫属和巴贝虫属之间，应将其定位于两属之间的位置[15]。【拟解决的关键问题】研究采用分子生物学方法，对所采集的样品进行检测和分析，探讨南北疆部分地区马匹对马泰勒虫感染的差异性及其系统发育关系。为新疆马泰勒虫的分布及其地方虫株的进化关系提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品

2017年3～5月分别在中国新疆巴音郭楞州和静县7个乡镇、阿勒泰2个县、吐鲁番托克逊县和伊犁昭苏种马场等区域分别采集了马血样288份、58份、11份、121份，共计478份，待检。

1.1.2 试剂

树脂型TM基因组DNA提取试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司；pEASY-T1 Clong Kit试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；EasyTap、EasyTap Buffer、dNTP等均购自Takara生物有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 马泰勒虫全基因组核酸的提取

严格参照基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取DNA，-20 ℃备用保存。

1.2.2 PCR目的片段的扩增及测序

引物参照罗金等[16]扩增马泰勒虫18S RNA基因的目的区段，上游引物：5'- TTTGGGCTGTTTACAGTTGC-3'；下游引物：5'- CTCAAAGTAAACGTCGAGTCATG-3'；由上海生工生物工程有限公司合成。采用25 μL反应体系以全血基因组DNA为模板，反应条件为95℃预变性5 min；94℃变性45 s；56℃退火30 s；72℃延伸30 s；30个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。将阳性样品(北疆的阿勒泰部分样品、南疆的托克逊部分样品)的PCR产物，使用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，将纯化产物进一步连接到pEASY-T1 Cloning Kit载体，导入Trans1感受态细胞，涂于LB固体培养基过夜培养单菌落，再经PCR鉴定，阳性样本送新疆昆泰锐生物技术有限公司进行序列测定。

1.2.3 系统发育

将测序获得的序列经NCBI(blast)分析，确定为马泰勒虫基因序列后，将并将阿勒泰、托克逊地区测序结果分别上传到Genbank，登陆号分别为MF398476、MF398477。并与GenBank上登录的马泰勒虫不同地方株18S rRNA基因序列，采用DNAStar软件中MegAlign进行多序列比对，采用 Mega 6.0软件构建遗传进化树，分析不同国家、不同区域间马泰勒虫的同源性及差异。用于进化分析的18S rRNA基因序列登录号分别为LC704749.1、EU642508.1、AY150062.2、JQ657703.1、JQ657703.1、AF704748.1、KF704749.1、AB515315.1、KM046918.1、KF429797.1。

2 结果与分析

2.1 经PCR扩增18 S rRNA基因

对所采集的马全血基因组DNA进行了马泰勒虫18S rRNA基因扩增，采用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳；成功扩增出了531 bp的阳性条带，与预计大小相符，详见图1。南北疆部分样品PCR检测结果见图2。图1，图2

M： DNA标准 DL 2000；1-2：马泰勒虫PCR产物；3：阴性对照

M： DNA Marker DL 2000；1-2：TheileriaequiPCR Products ；2：Negative control

图1 马泰勒虫PCR扩增结果
Fig.1 PCR amplification results of Theileria equi

M：DNA标准 DL 2000；1-23：马泰勒虫PCR产物；24：阴性对照

M：DNA Marker DL 2000；1-23：TheileriaequiPCR positive；24：Negative control

图2 南北疆部分马泰勒虫PCR扩增结果
Fig.2 PCR amplification results of Theileria equi in northern and southern

2.2 新疆南、北疆地区马泰勒虫PCR检测结果对比

对北疆阿勒泰、昭苏地区和南疆和静、托克逊地区所采集的样品进行马泰勒虫PCR检测、对比。研究表明，所检测的478份马全血中有107份感染马泰勒虫，感染阳性率为22.38%(107/478)。北疆地区马泰勒虫感染阳性率为13.96%(25/179)，其中采集于阿勒泰部分区域、昭苏县的马泰勒虫感染阳性率分别为12.06%(7/58)、14.87%(18/121)；南疆地区马泰勒虫感染阳性率为27.09%(78/299)，其中和静、托克逊马泰勒虫感染阳性率分别为27.08%(78/288)、36.36%(4/11)。表1

1～4岁、5～8岁、≥9岁感染率分别为25.74%、20.94%、20.00%。表2

2.3 新疆南、北疆不同年龄马感染泰勒虫情况

试验对北疆、南疆部分地区马匹感染马泰勒虫情况使用spss 20.0[17]进行独立样本T检验分析，发现北疆、南疆马泰勒虫感染存在显著性差异(P=0.001<0.05)；阿勒泰、昭苏、和静、托克逊四个地区进行单因素方差分析，发现阿勒泰与和静、昭苏与和静分别存在显著性差异(P=0.012<0.05；P=0.007<0.05)，不同年龄段马泰勒虫感染无显著性差异(P>0.05)。表3，表4

表1 不同地区马泰勒虫感染率
Table 1 The infection rate in different regions of Theileria equi

地区District样品数(份)Sample(portion)阳性数(份)Positivenumber(portion)感染率Prevalence(%)合计Total北疆Northern阿勒泰58712.06(7/58)昭苏1211814.87(18/121)13.96%(25/179)南疆Southern和静2887827.08(78/288)托克逊11436.36(4/11)27.09%(81/299)合计47813528.24(135/478)

表2 不同年龄段马泰勒虫感染率
Table 2 Infection rate of Theileria equi in different ages

感染率Prevalence(%)年龄 Agegroup1～4岁5～8岁≥9岁地区District阿勒泰6.25(2/32)20(4/20)16.67(1/6)昭苏37.03(10/27)10.34(6/58)5.5(2/36)和静27.83(27/97)26.54(30/113)26.92(21/78)托克逊36.36(4/11)00合计25.74(43/167)20.94(40/191)20.00(24/120)

表3 不同地区马泰勒虫感染统计
Table 3 Statistical analysis of infection in different regions of Theileria equi

地区District北疆 Northern南疆 Southern阿勒泰Aletai昭苏Zhaosu和静Hejing托克逊Toksun阿勒泰AletaiP=0.6710.0120.074昭苏Zhaosu0.0070.099和静Hejing0.465托克逊Toksun总计TotalP=0.01

表4 不同年龄段马泰勒虫感染统计
Table 4 Statistical analysis of infection in different age of Theileria equi

年龄段Agegroup1～4岁5～8岁≥9岁1～4岁0.2780.2505～8岁0.846≥9岁

2.4 系统发育

将阿勒泰(MF398476)、托克逊(MF398477)地方珠测序获得马泰勒虫18S rRNA 基因序列进行Blast比对，发现与Genbank上瑞典马泰勒虫地方株登录号为KM046918.1同源性为100%。选取不同国家马泰勒虫18S r RNA基因序列(登录号分别为：LC704749.1、EU642508.1、AY150062.2、JQ657703.1、JQ657703.1、AF704748.1、KF704749.1、AB515315.1、KM046918.1、KF429797.1)应用MEGA6构建进化树，进行系统发育分析，结果表明，印度、南非、西班牙、伊朗等地方株分为一支，扩增的18S rRNA 基因(MF398476、MF398477)与瑞典地方株分为一支。说明扩增的18S rRNA 基因(MF398476、MF398477)与瑞典地方株亲缘关系最近。图3

图3 18S rRNA基因核苷酸序列的遗传进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of 18 S rRNA gene nucleotide sequence

3 讨 论

新疆南、北疆气候差异明显，分别形成了独特的地域特点。新疆草地资源丰富，为马泰勒虫的传播媒介硬蜱孳生提供了有利条件，导致马泰勒虫的感染逐年上升[18]，严重制约了马产业的发展。研究对采自北疆伊犁昭苏种马场、阿勒泰，南疆巴州和静县、托克逊县共478份马全血样品进行了马泰勒虫感染情况检测，发现马泰勒虫总感染率为22.38%(107/478)，北疆地区感染率为13.96%(25/179)，南疆地区感染阳性率为27.09%(78/299)，该结果与李佳[19]检测马泰勒虫感染南疆高于北疆的情况基本一致。

检测结果经统计分析，北疆、南疆马泰勒虫感染存在显著性差异(P<0.05)，由于马泰勒虫经硬蜱传播的，故马泰勒虫感染与南北疆马泰勒虫的传播媒介(硬蜱)的区系分布相关。近年来，北疆地区融雪时间较晚，温度较低，硬蜱活动受限制，马泰勒虫传播受阻，感染率显得比南疆低。对采自不同年龄段马匹的感染情况进行了统计分析，发现1～4、5～8和9岁以上的马感染马泰勒虫差异均不显著，与前期试验研究结果相一致[20]。 马泰勒虫可在其体内携带(“带虫马”)长达7年之久[21], 因此每个年龄段的马匹都有很高的感染率。

国内对马泰勒虫的系统进化分析较少，仅罗金[22]、薛艳[23]对贵州、甘肃地区的马泰勒虫进行了相关遗传进化分析。试验对南北疆地区马泰勒虫的18S rRNA基因序列进行了测定和分析，结果表明，印度、南非、西班牙、伊朗等地方株聚为一支，扩增的18S rRNA基因(MF398476、MF398477)与瑞典地方株聚为一支。表明扩增的18S rRNA 基因(MF398476、MF398477)与瑞典地方株亲缘关系最近。说明新疆的马泰勒虫与瑞士马泰勒虫在发育过程中处于同一种系,它们有着更近的亲缘关系,在分类学中处于同样的地位。阿勒泰地区和托克逊地区的流行虫株存在差异性，这由于南北疆地区环境差异较大，蜱种也存在很大的差异性；也可能和区域间马属动物的进出口贸易有关，还可能和动物的迁徙以及皮革贸易中蜱的传播作用有关[23]。

提高对马泰勒虫的感染情况对比，北疆高于南疆的这种分布特点将对其流行病学调查有着重要的意义，同时可为该病的监控提出重点。在防控该病时，关键环节是其传播媒介蜱。硬蜱对天气的变化有强烈的敏感性，当气温较低或雨天后，硬蜱的数量都会急剧下降，马泰勒虫的感染也随之下降，灭蜱成为阻断该病传播的有效途径，更要加强马泰勒虫病的综合防控水平。

4 结 论

通过对马全血样品进行马泰勒虫感染情况检测，马泰勒虫总感染率为22.38%(107/478)，中国新疆北疆地区感染率为13.96%(25/179)，南疆地区感染阳性率为27.09%(78/299)，南疆地区感染率高于北疆，可能是南北疆气候差异较大，北疆地区冰雪融化时间较晚，其传播媒介硬蜱活动受限；不同年龄段马匹间感染差异均不显著，可能的原因是采样马的年龄主要集中到3～9岁，而在这个年龄阶段马较易感染马泰勒虫故差异不显著。扩增的18S rRNA 基因(MF398476、MF398477)经系统发育分析比较发现与瑞典地方株亲缘关系最近。

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DifferencesinTheileriaequiInfectionandItsPhylogeneticDevelopmentAnalysisinSomeAreasofXinjiang

LIU Shi-fang1, GUO Qing-yong1, WEN Xiu-xiu1, ZHANG Meng-yuan1,DANG Na-na2, Alax Abing3, Bayinchahan1

(1.CollegeofAnimalMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China;2.HejingAnimalHusbandryandVeterinaryStation,HejingXinjiang841300,China;3.ZhaosuAnimalHusbandryandVeterinaryStation,ZhaosuXinjiang835604,China)

ObjectiveTo understand the situation ofTheileriaequiand the genetic distance of local endemic strains strain ofTheileriaequiin Xinjiang.Method478 horse blood samples were collected from Southern and Northern Xinjiang, and Equine Theileriosis was investigated by PCR, the 18S rRNA gene was analyzed and the phylogeny tree was constructed based on Maximum Likelihood algorithm.ResultThe result showed that the infection rate in Northern Xinjiang was 13.96% (25/179), and the infection rate in Southern Xinjiang was 27.09% (78/299)； It was thought that the strains in India, South Africa, Spain, Iran and other places clustered into one branch and the strains with the genes (MF398476, MF398477) and Swedish local strains clustered into another branch.ConclusionThe infection rate of Equine Theileriosis between Northern and Southern Xinjiang displayed significant difference(P=0.001<0.05)，but there was no significant difference(P>0.05)in different age groups. The amplified Theileria equi in Altay and Tuokexun endemic strains (MF398477, MF398476) and the local strains of Switzerland (KM046918.1) had the closest relationship. The test provided a data to support the control of Equine Theileriosis and the accurate classifying status ofTheileriaequi.

Theileriaequi; northern and southern Xinjiang; phylogeny

Supported by: National Natural Science Foundation-Xinjiang Joint Fund Key Projects"The Equine Piroplasmosis Epidemic Regularity and Advantages of Ticks in Xinjiang: Biological Characteristics and Detection Techniques of Vectors Research" (U1403283)and Research and Innovation Projects of Graduate Students of Xinjiang Agricultural University "Screening and treatment of Chinese and Western medicine for Theileriosis Equi" (XJAUGRI2016-009)

Bayinchahan(1964-),female,Bazhou,Xinjiang,Master. research field:Parasitic immunology and molecular biology of protozoa. (E-mail)bynch@hotmail.com，2514062881@qq.com

S852.7

A

1001-4330(2017)11-2130-08

2017-09-14

国家自然科学基金项目-新疆联合基金重点项目“新疆马梨形虫病流行规律及其优势媒介蜱生物学特性和检测技术的研究”(U1403283)；新疆农业大学研究生科研创新项目课题“马泰勒虫病中西药物效果筛选及治疗”(XJAUGRI2016-009)

刘世芳(1990-)，男，云南曲靖人，硕士研究生，研究方向为临床兽医学，(E-mail)727640930@qq.com

巴音查汗(1964-)，女，新疆巴州人，教授，研究方向为寄生虫免疫学及原虫分子生物学，(E-mail)bynch@hotmail.com，2514062881@qq.com