棉花品种SSR标记变性与非变性PAGE检测法的比较研究

刘国栋+王芙蓉+张传云+陈煜+张景霞+杜召海+张军

摘要：本研究以12份棉花品种为材料，用三对多态性丰富的SSR引物对变性和非变性PAGE检测法进行比较分析。结果表明，两种检测方法鉴定单株个体基因型的类型一致；变性PAGE检测法检测结果清晰，但操作过程繁琐；非变性PAGE检测法操作相对简单、检测通量高，更适用于材料的高通量检测分析。

关键词：棉花；SSR；聚丙烯酰胺凝胶电泳；银染

中图分类号：S562文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）11-0131-03

Comparison of Denatured and Non-Denatured

PAGE Detection Method on Cotton SSR Markers

Liu Guodong， Wang Furong， Zhang Chuanyun， Chen Yu， Zhang Jingxia， Du Zhaohai， Zhang Jun

（Cotton Research Center of Shandong， Jinan 250100，China）

AbstractThree SSR primer pairs with high polymorphism and 12 cotton varieties were used to comparatively analyze the denatured and non-denatured PAGE detection methods. The results indicated that the type of individual genotype which was identified by the two detection methods was consistent. The testing results of denatured PAGE were more clear， but its operation process was complex. The operation process of non-denatured PAGE was simple and it had high test flux， which was more suitable for high throughput detection analysis.

KeywordsCotton； SSR； PAGE； Silver staining

SSR（Simple Sequence Repeat）又称简单序列重复，均匀地分布在整个真核生物基因组中，具有共显性、多态性丰富等优点，是构建DNA指纹图谱、研究群体遗传学、进行分子标记辅助育种的理想工具。SSR标记技术是目前最为成熟的DNA检测技术，具有灵活、简便、成本低的优势。目前，最常用的SSR检测方法主要是变性PAGE银染检测法和非变性PAGE银染检测法。变性和非变性PAGE检测法在检测微卫星产物方面各有优劣，许多学者在比较两种检测方法时都发现在非变性胶中存在较多非特异性条带[1-4]。但两种检测方法有何异同点和选择何种方法进行SSR分子检测效果更好等问题一直是困扰分子标记检测研究者的主要问题。本试验选用12个棉花品种及三对多态性丰富的SSR引物，对变性与非变性PAGE银染检测法进行比较分析，为合理有效利用两种电泳检测方法提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

本试验所用12个棉花品种为山东省区试棉花品种。选用三对多态性丰富的SSR引物（NAU1102、NAU3254和NAU3995）进行棉花品种的分子标记基因型分析，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.2试验方法

1.2.1DNA提取将单粒棉种浸泡至种皮松软后剥掉种皮，放入2 mL离心管中，加入700 μL裂解缓冲液（成分：2% CTAB，0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，2% PVP，1% β-巯基乙醇）研磨。65℃水浴20 min，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），混匀至不分层，12 000 r/min离心8 min，取上清，重復抽提一次取上清，加入0.7倍体积异丙醇，混匀至DNA成团析出，70%乙醇洗涤DNA沉淀1次，无水乙醇洗涤1次，晾干后加入200 μL双蒸水，待充分溶解后备用。

1.2.2PCR扩增PCR扩增反应体系：10 μL反应液中包括10×PCR buffer 1.0 μL， 10 mmol/L dNTP Mix 0.2 μL，正、反向Primer（10 μmol/L）各0.6 μL， 5 U Taq DNA聚合酶 0.1 μL， DNA（20～200 ng/μL）2 μL，ddH2O 5.5 μL。扩增反应程序为：94℃预变性5 min，1个循环；94℃变性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，共32个循环；72℃延伸10 min，1个循环；4℃保存。

1.2.3PCR扩增产物的电泳检测变性PAGE银染检测法。电泳：PCR产物95℃变性5 min， 4℃保温10 min， 然后在6%变性胶上分离。预电泳90 W，20 min，用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，梳齿朝内插入梳子形成加样孔。每孔加样5 mL，90 W恒功率电泳至指示带（二甲苯氰）到达胶板的中部，电泳结束。采用的银染方法：固定液（10%无水乙醇+0.5%冰醋酸）中轻轻晃动5 min；染色液（0.2% AgNO3溶液）中摇动染色8～10 min；dH2O中摇动30 s；显影液（3% NaOH+0.5%甲醛）中摇动至显示出清晰的条带；10%冰醋酸溶液中定影5 min。

非变性PAGE银染检测法。电泳：预电泳80 W，20 min，每孔加样1.2 μL， 80 W恒功率电泳至指示带（二甲苯氰）到达胶板的下部，电泳结束。采用的银染方法：0.1wt%的AgNO3溶液中染色8～10 min；dH2O快速漂洗1次，不超过10 s；2wt% NaOH和0.4wt%甲醛的水溶液中显影至带型清晰；10%冰醋酸溶液中定影5 min。

2结果与分析

2.1两种方法检测结果的比较

利用三对多态性丰富的SSR引物（NAU1102、NAU3254和NAU3995）对12个棉花品种进行PCR扩增，分别在6%聚丙烯酰胺变性凝胶和8%聚丙烯酰胺非变性凝胶上分离PCR产物，结果在变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶中均能检测出目的片段（图1、2和图3）。图1显示，引物NAU1102的PCR产物在变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶中均检测到3种带型；图2显示，引物NAU3254的PCR产物在变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶中也均检测到3种带型；图3显示，引物NAU3995的PCR产物在变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶中均能检测到5种带型。三对SSR引物的检测结果在变性胶中都只有目的条带，而且带型清晰易于鉴定；在非变性胶中除目的条带外，还有较多的非特异性条带，而且目的条带带型和非特异性条带带型能一一对应。由此可见，变性和非变性PAGE检测法在鉴定个体基因型方面检测结果无差异。

2.2两种方法工作效率的比较

由表1可知，变性PAGE检测法操作过程复杂，在胶板制备时需要对玻璃板进行预处理，背板和面板分别需用剥离硅烷和亲和硅烷擦拭两次，然后灌胶，最后组装胶板；电泳时需要对PCR产物进行变性处理；染色时，由于变性PAGE电泳的凝胶极薄，需要粘附在胶板上进行染色，因此检测成本较高、检测通量较低；整个检测过程约需3.5 h，工作效率不高。非变性PAGE检测法操作过程相对简单，在胶板制备时无需对胶板进行预处理，直接组装玻璃板、灌胶；电泳时无需对PCR产物进行变性处理；染色时，直接对非变性聚丙烯酰胺凝胶进行染色，而且省略了固定步骤，检测通量高；整个检测过程仅需1.5 h，工作效率大大提高。总之，在检测效率方面，非变性PAGE银染检测法操作简单、污染小、成本低，非常适合用于分子标记基因型的高通量检测。

表1变性和非变性PAGE检测法比较方法制备胶板电泳染色用时（h）变性PAGE检测法需预处理需预处理3个步骤约3.5非变性PAGE检测法不需要预处理不需要预处理2个步骤约1.5

3讨论与结论

本研究通过比较12个棉花品种的PCR扩增结果在变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶上的带型表现，发现变性PAGE检测法和非变性PAGE检测法的分辨率无明显差异；非变性聚丙烯酰胺凝胶中虽然有非特异性条带，但在检测分子标记基因型方面两种检测方法无差异；在检测效率方面两种检测方法差异明显。究其原因有以下几个方面。①聚丙烯酰胺凝胶的有效分離范围与其浓度相关，两种检测方法均采用聚丙烯酰胺凝胶，且二者浓度差异不大，因此分辨率差异不明显。②非变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离双链DNA，PCR扩增产物在复性过程中除了形成由特异扩增产物组成的正常双链外，有些SSR引物位点的PCR扩增产物还会形成异源双链，异源双链由于空间构象的影响，迁移率较低，形成非目的条带。王晓通等[5]通过对非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中与杂合子相伴产生的非目的条带的鉴定分析证明了非目的条带不是非特异性扩增的结果，而是在复性过程中形成的异源双链。变性聚丙烯酰胺凝胶在配制和加样过程中加入了变性剂，在变性聚丙烯酰胺凝胶中，目的条带以特异性扩增序列的单链形式存在，其迁移速率不受碱基组成及序列构象的影响，因此，变性PAGE检测法鉴定的目的条带比较清晰。③变性PAGE检测法需要对胶板和PCR扩增产物进行前期处理，因此检测效率不及非变性PAGE检测法。

综合比较两种检测方法，结果表明，两种检测法均能检测出目的片段，但变性PAGE检测法操作过程繁琐、成本高、耗时耗力、效率低；非变性PAGE检测法经济快速，非常适合进行分子标记基因型的高通量检测，如品种的纯度鉴定、分子遗传多样性研究等。

参考文献：

[1]曲鲁江， 李显耀， 杜志强，等. 微卫星PCR产物变性与非变性PAGE-银染检测方法的比较[J]. 遗传， 2004， 26（4）：522-524.

[2]张春雷， 佟广香， 匡友谊，等. 微卫星产物变性与非变性PAGE-银染方法比较[J]. 水产学杂志， 2010， 23（1）：11-14.

[3]连伟， 翁宏飚. 变性与非变性PAGE在检测家蚕微卫星PCR产物中差异[J]. 蚕桑通报， 2012， 43（4）：19-22.

[4]王爱听， 李永生， 穆延召，等. 玉米微卫星PCR产物变性与非变性PAGE-银染法的比较分析[J]. 玉米科学， 2013， 21（3）：48-51.

[5]王晓通， 连林生， 赵春江，等. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中与杂合子相伴产生的非目的条带的鉴定[J]. 农业生物技术学报， 2010， 18（3）：616-622.山 东 农 业 科 学2017，49（11）：134～137Shandong Agricultural Sciences山 东 农 业 科 学第49卷第11期刘玲雪，等：氯化铯密度梯度离心法提纯枣疯病植原体DNADOI：10.14083/j.issn.1001-4942.2017.11.027

收稿日期：2017-04-05