外源NO对转基因白桦外源基因表达及DNA甲基化的影响

孙丰坤 李思达 李吉祥 陈晓慧 曾凡锁,2*

(1.东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040； 2.林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040)

外源NO对转基因白桦外源基因表达及DNA甲基化的影响

孙丰坤1李思达1李吉祥1陈晓慧1曾凡锁1,2*

(1.东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；2.林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040)

为探讨外源NO诱导转基因白桦外源基因表达与基因组DNA甲基化之间的关系，本研究分析了NO供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)对转基因白桦愈伤组织中外源基因BGT转录的影响，并对此过程中基因组DNA甲基化水平、甲基转移酶基因DRM、MET表达量及生理生化指标进行研究。结果表明：2 mmol·L-1SNP处理后，转基因白桦防御酶活性、丙二醛(MDA)含量显著升高，表明高浓度NO对白桦细胞正常生命活动产生了伤害；甲基转移酶DRM和MET基因上调表达，基因组DNA甲基化水平由10.6%增加到16.5%，外源基因BGT表达量在6 h时显著增加，3 d时仅为对照的0.46倍，说明转基因白桦外源BGT基因的表达对高浓度NO响应明显且受基因组甲基化水平的影响。本研究揭示了转基因白桦外源BGT基因和甲基转移酶MET、DRM基因对高浓度NO的响应模式，分析了基因组甲基化水平及生理生化特征的变化，为转基因植物生长发育的表观遗传调控和外源基因表达影响机制的研究奠定基础。

NO；转基因白桦；基因表达；甲基化

从NO(1992年)被Science评为“年度明星分子”以来，对其功能的研究逐渐成为植物学领域的热点，NO对植物的影响具有浓度效应[1]，低浓度NO能够增强植物抗逆性[2～4]，调节植物的生长发育[5～6]，特异性诱导植物发生去甲基化[7～8]，但当NO浓度高于0.05 mmol·L-1则会对植物基因组造成损伤，抑制植物生长甚至死亡。近年来NO的过量污染正在加剧，主要有臭氧层空洞、酸雨、汽车尾气、水体污染、光化学烟雾等，正在威胁着植物生长和人类生产劳作，外源高浓度NO对植物基因组甲基化水平的影响研究较少，特别在木本植物中还未见报道。因此对高浓度NO环境下植物生理生化特征及基因组遗传稳定性的研究成为本研究的主要目标。

DNA甲基化是转基因植物中外源基因沉默的主要原因，转入的外源基因或其整合位点通常会受到植物本身的排斥而发生甲基化，影响基因正常表达[9～10]。同时，转基因植物在长期生长过程中，环境胁迫和信号产生的表观变异对外源基因的表达的至关重要[11]。因此，外界高浓度NO对转基因植物基因组DNA甲基化水平、外源基因的表达水平及此过程中植物防御酶系统的影响成为本研究的主要目的。本研究通过2 mmol·L-1SNP处理转基因白桦愈伤组织，检测了外源基因BGT、甲基化转移酶基因MET、DRM表达量及生理生化特征的变化情况，并分析白桦基因组DNA甲基化水平及模式，揭示了白桦基因组DNA甲基化、甲基转移酶MET、DRM对NO响应模式、NO对白桦外源基因BGT表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

转基因白桦材料为詹亚光等(2001)获得的转BGT抗虫基因单拷贝高表达的无性系TP46实生苗。利用WPM培养基(附加12 mg·L-1BA，20 g·L-1蔗糖，5.3 g·L-1琼脂)，pH为5.5～6.0，诱导转基因白桦实生苗腋芽长出白桦组培苗，切取转基因白桦组培苗茎段，利用NT培养基(附加0.1 mg·L-1BA+0.01 mg·L-1TDZ，20 g·L-1蔗糖，5.3 g·L-1琼脂)，pH为5.5～6.0，诱导获得转基因白桦愈伤组织，每隔20 d继代1次，培养温度为25～27℃，光照强度为150 μmol·m-2·s-1，光照16 h·d-1。

将NO供体SNP添加到转基因白桦愈伤组织培养体系中(50 mL培养基接种4 g(FW)愈伤组织)，使SNP终浓度为2 mmol·L-1，对照组加入等体积无菌水，分别在6 h、12 h、3 d、5 d、7 d取材，每个处理重复3次。

1.2 方法

1.2.1 生理指标测定

称取0.3 g(FW)白桦愈伤组织，测定超氧化物歧化酶(SOD)[12]、过氧化物酶(POD)[13]、过氧化氢酶(CAT)[13]、苯丙氨酸解氨酶(PAL)[14]的活性及丙二醛(MDA)[14]含量。

1.2.2 基因表达量检测

采用CTAB法提取白桦愈伤组织总RNA，利用TOYOBO反转录试剂盒反转录1 μg RNA成cDNA作为模板，模板稀释10倍后使用Applied Biosystems 7500进行qRT-PCR，引物见表1,实验方法参照TOYOBO荧光定量试剂盒说明书，每个样品重复3次，采用2-△△CT法进行结果分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3随机扩增多态性DNA标记技术(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)检测表观遗传变异

采用CTAB法提取白桦愈伤组织基因组DNA，用HpaⅡ、MspⅠ内切酶分别对DNA进行酶切，PCR筛选得到20对可产生多态性片段的引物(表2)，经琼脂糖凝胶电泳后依据条带变化进行胞嘧啶甲基化分析，原则如下：若MspⅠ酶切后扩增有条带而对应的HpaⅡ没有带，其后发生变化的，为内侧胞嘧啶完全甲基化位点；若HpaⅡ酶切后扩增有条带而对应的MspⅠ没有带，其后发生变化的，为外侧胞嘧啶半甲基化位点；若HpaⅡ和MspⅠ酶切后扩增均有条带，其后发生变化的，为未甲基化位点。

表2 RAPD引物名称及序列

2 结果与分析

2.1 2 mmol·L-1SNP处理下转基因白桦甲基转移酶基因DRM、MET及外源基因BGT表达分析

2 mmol·L-1SNP处理下转基因白桦无性系TP46甲基转移酶基因MET、DRM(图1A)均上调表达。MET基因转录水平呈现先上升后下降的趋势，3 d时表达量达到最大值，为对照组的51.1倍；DRM基因响应时间较早，12 h时达到最大值，为对照组的38.1倍，之后表达量开始下降但仍高于对照组。外源基因BGT(图1B)响应明显，6 h前BGT基因上调表达，12 h表达量下降，仅为对照组的0.46倍，之后转录水平升高且均大于对照组，3 d时出现最大值，为对照组的16.9倍。

2.2 2 mmol·L-1SNP处理下转基因白桦生理指标分析

植物依靠体内SOD、POD、CAT的酶促反应清除过量的氧活性自由基，从而维持细胞内活性氧的平衡。2 mmol·L-1SNP处理后，SOD、POD、CAT活性均显著升高。SOD活性先上升后下降再上升，6 h、12 h时SOD活性显著高于对照；POD、CAT活性呈逐渐升高的趋势，分别在3 d后和7 d时显著高于对照组。PAL作为催化苯丙烷类代谢反应的限速酶，在植物生长发育、抗病抗逆境中起重要作用，2 mmol·L-1SNP处理后，PAL活性呈现逐渐升高的趋势，5 d时酶活性最高，为对照组的1.03倍。

图1 2 mmol·L-1SNP处理下DRM、MET及BGT基因相对表达量Fig.1 Relative expression of DRM,MET and BGT genes in birch under 2 mmol·L-1 SNP treatment

RAPD总位点数TotalnumberofRAPDsites未甲基化CCGG位点数NonmethylatedCCGGsites(%)甲基化CCGG位点数MethylatedCCGGsites(%)内侧全甲基化位点数Numberofinnermethylationsites(%)外侧胞嘧啶半甲基化Numberofoutermethylationsites(%)对照Control198177(89.39)21(10.6)13(61.91)8(38.09)6h195174(89.23)31(15.9)18(54.55)13(39.39)12h210180(85.71)30(14.29)14(46.67)16(53.33)24h185157(84.86)28(15.14)16(57.14)12(42.86)3d200167(83.50)33(16.50)11(48.65)12(51.35)5d230194(84.35)36(15.65)20(55.56)16(44.44)7d208178(85.58)30(14.42)17(56.67)13(43.33)

图2 2 mmol·L-1SNP处理后转基因白桦防御酶活性及MDA含量Fig.2 Defense enzyme activity and MDA content of birch treated with 2 mmol·L-1 SNP

MDA是植物细胞膜膜脂氧化的产物，其含量在一定程度上可反应植物损伤程度。2 mmol·L-1SNP处理后，白桦组织内MDA含量显著增加，在24 h时MDA含量达到对照的4.65倍，之后MDA含量一直维持较高水平且差异显著。

2.3 2 mmol·L-1SNP处理下转基因白桦DNA甲基化水平分析

利用甲基化敏感不同的MspⅠ和HpaⅡ结合RAPD分子标记技术，检测了2 mmol·L-1SNP处理后转基因白桦愈伤组织DNA甲基化水平及模式的改变。通过对20对引物产生多态性片段(图3)及DNA甲基化模式、水平(表3)进行差异统计，20对引物21个模板共得到575条条带，SNP处理使转基因白桦基因组DNA甲基化水平明显升高，3 d时达到最大值，占全部RAPD位点数的16.5%，TP46白桦甲基化位点数平均值达到14.8%，主要以内侧胞嘧啶甲基化为主，占整体甲基化水平的54.45%。

图3 S29号引物多态性扩增结果 M. MspⅠ；H. HpaⅡ；A-D.差异条带位置Fig.3 The polymorphism amplification results of S29 primer M. MspⅠ；H. HpaⅡ；A-D.The position of the difference strips

3 讨论

NO作为激活植物过敏性反应和系统获得性抗性的内源信号分子广泛存在于植物体内，不但能够调节植物生长发育过程，还在非生物胁迫中发挥重要作用[2～6,15]，其通过复杂的信号通路一方面减少活性氧ROS的生成，另一方面可以诱导抗氧化酶活性的升高来减轻氧化胁迫伤害[16]。但高浓度NO却会对植物的生长产生毒害作用[1]。

本研究发现，2 mmol·L-1SNP处理的白桦愈伤组织中，活性氧自由基清除酶SOD、POD、CAT在不同时间达到其活性最大值且与对照组差异显著，PAL活性显著增强，说明白桦通过防御酶活性的升高来减轻外界SNP对细胞的伤害，维持正常生命活动；同时MDA含量的降低也可以看出随着时间的延长，白桦膜系统的伤害程度逐渐降低，但直至7 d，MDA含量仍高于对照组，再次证明了高浓度NO会对植物产生毒害作用。NO提高防御酶活性的主要原因是其对含铁相关酶类有很高亲和性[17],本研究中NO对植物防御酶活性诱导效果不同的原因可能与NO在相关酶信号转导中的位置有关，也可能与外界高浓度SNP胁迫下防御酶在膜脂过氧化中的位置和调节机制有关。

NO不但参与了植物的生长发育和对外界胁迫应答等生理过程[5,15]，还会对植物基因组的表观遗传稳定性产生影响，诱导DNA甲基化的变异[18]。植物中MET基因具有维持CpG位点甲基化功能，能够维持植物体内的甲基化水平[19]，DRM具有催化DNA从头甲基化的活性，在响应相应信号和建立甲基化印记中发挥重要作用。本研究中高浓度SNP处理下，白桦基因组DNA甲基化水平显著升高，甲基化位点总数由10.6%增加到了16.5%，这与高粱中的研究结果一致[9]，表明高浓度NO使白桦DNA甲基化水平显著升高。白桦DRM基因表达量对高浓度NO响应明显，在12 h时达到最高，说明白桦基因组内发生了从头甲基化，白桦MET基因同样表现为上调表达，在3 d时表达量达到最高，推测原因是此时白桦基因组内的高甲基化水平的维持需要MET的参与，总之，白桦甲基转移酶DRM和MET的上调表达在基因组DNA甲基化水平升高过程中起着重要作用，白桦基因组甲基化水平的增加可能是为了抵御外界高浓度NO对白桦的损伤。

众所周知，DNA甲基化是转基因植物外源基因沉默的主要原因，本研究材料为转BGT抗虫基因单拷贝且高表达的无性系TP46白桦，2 mmol·L-1SNP处理6 h时，外源基因BGT基因上调表达，表明外源基因BGT对外界高浓度NO响应明显；6 h后，白桦甲基转移酶DRM基因表达量逐渐升高，基因组DNA甲基化水平显著增加，外源BGT基因的表达量开始下降，12 h时，白桦DRM基因表达量达到最高，此时外源BGT基因表达量仅为对照组的0.46倍，可以看出，6 h后白桦DRM基因表达量的升高及基因组甲基化水平的增加使得外源BGT基因的表达受到抑制。有意思的是，6 h后虽然白桦MET基因转录及基因组DNA甲基化维持在一个较高水平，但BGT基因表达量却在24 h后开始升高且在3 d时达到最大值，推测原因是在白桦基因组DNA甲基化水平不变的情况下，外源基因BGT相关表达核酸序列发生了去甲基化，转录水平逐渐升高直，同样Boyko等在研究LRR转基因烟草时发现，烟草花叶病毒侵染烟草后导致基因组DNA甲基化水平升高，但抗病基因LRR结构域编码区段甲基化水平却在降低[20]。本研究中对于外源基因BGT相关核酸序列是否发生了去甲基化还需进一步研究。

综上所述，本研究分析了外源高浓度NO对转基因白桦外源基因BGT表达量的影响，明确了基因组DNA甲基化水平及模式、生理生化特征的变化情况，为进一步研究外界高浓度NO对植物生长发育的调控机制提供理论依据，同时为以后的林木遗传育种及生产实践提供理论依据及方法参考。

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The central university basic research business expenses special fund project(2572014DA04)；National Natural Science Foundation of China(J1210053,31200463)

introduction：SUN Feng-Kun(1989—),male,master,the main research direction: plant genetic engineering.

date:2017-03-16

EffectsofExogenousNitricOxideonExogenousGeneExpressionandDNAMethylationinTransgenicBirch

SUN Feng-Kun1LI Si-Da1LI Ji-Xiang1CHEN Xiao-Hui1ZENG Fan-Suo1,2*

(1.College of Life science,Northeast Forestry University,Harbin 150040； 2.Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology of Nation,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

In order to investigate the relationship between transgene expression and the methylation of genomic DNA induced by 2 mmol·L-1SNP in Transgenic birch, the effect of SNP(sodium nitroprusside) on the expression of exogenousBGT, methyltransferase geneDRM,METand the level of DNA methylation were determined in transgenic birch callus. The activities of defense enzymes and the MDA(malondialdehyde) content in transgenic birch were increased significantly, which indicated high concentration of NO had harm on the normal life of birch cells. The methyltransferaseDRMand MET genes were up-regulated and the methylation level of genomic DNA was increased from 10.6% to 16.5%. The transcription level ofBGTwas improved at 6 h and only 0.46 folds of the control at 3 d, which suggested the expression of exogenousBGTgene in transgenic brich was affected by high concentration of NO and the level of genomic methylation. The results revealed the response patterns of exogenous gene and methyltransferase gene and determined the genomic methylation level and physiological and biochemical characteristics to the high concentration of NO in birch, which will provide some references for further study of epigenetic regulation and regulation of exogenous gene expression in transgenic plants.

NO;transgenic birch;gene expression;methylation

中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572014DA04)；国家自然科学基金项目(J1210053,31200463)

孙丰坤(1989—)，男，硕士研究生，主要从事植物基因工程方面的研究。

* 通信作者：E-mail：zeng@nefu.edu.cn

2017-03-16

* Corresponding author：E-mail：zeng@nefu.edu.cn

S792.153

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.06.010