中药附子毒效多维评价与整合分析的思路与实践

彭 成

(成都中医药大学药学院,中药材标准化教育部重点实验室,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地,成都,611137)

专题——中药“毒、效”整合分析研究

中药附子毒效多维评价与整合分析的思路与实践

彭 成

(成都中医药大学药学院,中药材标准化教育部重点实验室,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地,成都,611137)

本文针对中药安全性、有效性备受质疑的现状,系统阐述了中药毒效的认知过程和基本内涵,提出中药毒效“系统中药、多维评价、整合分析”的研究思路与方法,并以附子为例,系统研究评价附子毒效在系统中药中“品种、品质、制药、药性、功效、应用”的表现形式,整合分析附子“毒效”的物质基础、作用机制和增效解毒原理。

附子;毒效;系统中药;多维评价;整合分析

1 中药毒效评价与整合分析是中药学科发展必须面临和解决的科学问题

安全性、有效性和可控性是药品的基本属性,其中安全性和有效性是其核心,简言之就是药品的“毒”与“效”是药品发现、研发和应用的根本。中药的有效性和安全性不仅是中医药传承和发展的坚实基础,也是中医药服务于世界人民健康事业的根本前提。然而,继比利时中药减肥事件、新加坡黄连事件、日本柴胡事件、英国千柏鼻炎片和复方芦荟胶囊事件、马兜铃酸事件、鱼腥草注射液事件、何首乌事件之后,中药材熏硫、汉森制药“槟榔入药”、云南白药与“乌头碱”、同仁堂多种中成药含重金属等成为国内外公众关注的热点问题[1-2],中药的安全性和有效性备受质疑。

面对质疑,科学总结中药毒性与疗效的历史沿革与研究现状,多学科交叉融合、整合分析中药毒效的物质基础、作用原理、毒效关系,揭示“有故无殒、中病即止”的科学内涵,是关系到我国中药药品安全与国际民生的大事。

中医药对中药“毒”“效”的认识源远流长,内涵非常丰富,是中华民族在长期与疾病作斗争的医疗实践和现代药理毒理研究过程中,逐渐形成的知识和技术体系。我国现存本草文献中关于中药毒性、功效理论的记载,最早见于《神农本草经》,用“有毒无毒”来标明药物的属性,并将其所载365味药物,依照有毒无毒、延年益寿及祛邪分为上中下三品,云“下品多毒,不可久服”,如大戟、芫花、甘遂、乌头、附子、巴豆、狼毒等列入此类,毒性强烈易致死亡。在具体药物条目下标有“毒性”的文献,最早见于《吴普本草》,此后历代本草著作在各药物条目下,一般都有“有毒”或“无毒”的记载,或按大毒、有毒、小毒或微毒以标注其毒性的大小,以保证用药安全。但传统有毒性的中药,性猛力强,取效甚捷,应用得当,疗效卓著,中医药对其安全应用有独到的认识,犹为历代名医大师所习用。真正进行中药“毒”“效”的现代研究,始于19世纪中叶,西方医药进入了我国后,老一辈医药学家开始应用现代毒理学的理论、技术和方法来研究中药的毒性、毒作用机制及产生毒作用的物质基础。尤其近年来,国家高度重视有毒性中药的研究和应用,先后支持国家自然科学基金项目、国家973计划等项目100多项,研究涉及传统有毒性的中药和现代研究发现有毒性的中药,如川乌、附子、雷公藤、马钱子、半夏、大戟、芫花、蟾酥、砒霜、雄黄、朱砂、苍耳子、黄药子、关木通、何首乌、补骨脂、马兜铃酸、柴胡总皂苷、千里光吡咯里西啶生物碱等,尤其是国家自然科学基金重点项目资助彭成教授进行了“乌头类有毒中药安全性研究”,首次建立了“毒性物质基础-毒作用机制-控毒方法体系”的有毒性中药安全性评价模式[3];重大研究计划重点资助上海交通大学陈竺院士进行了“硫化砷与青黛联合治疗白血病的分子机制研究”[4],重点项目资助上海中医药大学王峥涛教授进行了“龙胆苦苷对肝毒吡咯里西啶生物碱所致肝损伤的保护作用及其分子机制”[5]。国家重点基础研究发展计划(973计划),资助了中国中医药科学院叶祖光研究员负责的“确有疗效的有毒中药科学应用关键问题的基础研究”[6]、南京中医药大学段金廒教授负责的“中药“十八反”配伍理论的关键科学问题研究”[7]。国家中医药管理局也批准在成都中医药大学和中国中医科学院建立中药毒理学重点学科;中国中医药出版社出版了由彭成教授主编的新世纪创新教材《中药毒理学》,总结了有毒中药的最新研究成果[8]。2015年11月13—15日国家自然科学基金委员会在成都主持召开了第149期“双清论坛”。论坛主题为“中药‘毒与效’的整合分析”;论坛主席由中国科学院院士、四川大学冯小明教授,中国工程院院士、中国药科大学王广基教授、成都中医药大学彭成教授和中国人民解放军第302医院肖小河研究员共同担任,与会专家分析研讨了本领域的重大科学问题,总结凝炼了未来急需关注与解决的重要基础科学问题[9]。因此,科学阐释中药的毒性与疗效,科学总结有毒中药的应用规律,尤其随着精准医学时代的到来、基础生命科学新技术的渗透和国际毒理学学科的蓬勃发展,揭示中药“毒”“效”的科学内涵,整合分析有毒性中药的物质基础、作用机制、增效减毒原理,阐明有毒性中药治疗疑难重症的毒效机制,建立风险评估方法、早期预警机制,促进中药“毒”“效”研究的现代化和国际化,具有重要的现实意义。

2 多维评价与整合分析是破解中药毒效科学内涵的有效方法

中药毒效的内涵非常丰富。“毒”的含义主要有3种[10]:1)“毒”就是药,凡治病之药皆为毒药,如《周礼·天官家宰》“医师掌医之政令,聚毒药以供医事”。2)“毒”指中药的偏性,如张介宾在《类经·疾病类·五脏病气法时》中说:药以治病,以毒为能。所谓毒者,因气味之偏也,盖气味之偏,药饵之属也,所以祛人之邪气。3)“毒”是指中药的不良反应,如隋·巢元方在《诸病源候论》中提到,“凡药物云有毒及大毒者,皆能变乱,与人为害,亦能杀人”,张景岳《类经·脉象类》指出“毒药,谓药之峻利者”。“效”即“功效”,是指在中医理论指导下中药治疗作用和保健作用的高度概括[11]。治疗功效又可分为消除疾病发生的原因、发挥治本作用的对因治疗功效和改善疾病症状、发挥治标作用的对症治疗功效,以及对疾病直接发挥治疗作用的对病治疗功效。1)对因治疗作用不外是祛除病邪,消除病因,恢复脏腑功能的协调,纠正阴阳偏盛偏衰的病理现象。简言之,即祛邪、扶正、调理脏腑功能。2)对症治疗作用是指中药治疗功效中能消除或缓解患者自觉痛苦症状或临床体征的特殊效用。对病治疗功效就是针对中医的“病”发挥治疗作用的功效,如截疟、驱蛔虫等,分别针对疟疾、蛔虫病发挥治疗作用。保健功效是在中医药理论指导下将中药对人体预防或养生、康复等作用进行概括和总结而形成的,包括预防功效和养生功效。1)预防功效是指采用以药物为主的多种手段,如烟熏、洗浴、佩带或内服等,防止某些疾病的发生和发展。2)养生功效指用中药以增强人体适应能力,强身健体,调理情志,养护脏腑,延缓衰老等方面的作用。

中药“毒”“效”的物质基础复杂多样,且在不同的病理(病证)状态下,毒性物质基础与药效物质基础的角色可以发生转换。中药“毒性”与“功效”表现复杂多种,且中药多成分、多靶点、多途径的作用特点使其毒效机制研究复杂。尤其是在中医药长期的临床实践中,逐渐形成了依法炮制、对证用药、合理配伍、控制剂量等增效减毒、增效控毒的方法,属中医药的原创思维,独具特色和优势。由此可见,影响中药“毒与效”的因素很多,即涉及到药物的因素,又涉及到机体的状态,还涉及到临床应用的方式,即“药物-机体-应用”之间的多维关系。

要科学揭示“毒效”的科学内涵,科学解读有毒性中药的“药物-机体-应用”之间的多维关系,就必须打破传统的惯性思维和研究方法,按照“系统中药、多维评价、整合分析”的思路,破解中药毒效科学内涵。

中药的毒性与功效是客观存在的,是中药的基本属性,但并不意味着任何中药,在任何情况下都会对人体造成伤害,引起毒性反应。中药使用后,是否对人体造成伤害、出现毒性反应,以及毒性的大小,主要与药物的毒性、机体的状态和临床是否合理应用有关。因此,中药毒效的研究,必须应用“系统中药”的思维方式,对有毒性中药的“品、质、制、性、效、用”进行多维评价[12-14],对有毒性中药的“毒-效”物质基础-“毒-效”机制-增效减毒原理进行整合分析[9,15],从而揭示中药“毒”“效”的物质基础,阐明“毒”“效”物质对机体的作用、作用环节与效应,以及“毒”“效”物质基础在体内吸收、分布、代谢、排泄的动态变化过程及在不同的病理(病证)状态下,毒性物质基础与药效物质基础的角色相互转换的条件、过程、结果;尤其要坚持中医药理论特色,多学科交叉合作,在系统毒理学、网络药理学指导下,研究评价中药“药物(药材-饮片-组分-成分)-机体(整体-靶器官-靶细胞-靶分子)-应用(道地药材-依法炮制-制备方法-对证用药-合理配伍-剂量疗程)”等系统关键要素的多维关系,整合研究分析减毒增效或控毒增效的理论、技术和临床实践,破解中药“毒-效”研究的难题。

3 附子毒效多维评价与整合分析的思路与实践

附子的应用历史悠久,治疗效果显著。早在公元前140年《淮南子》中就有“天雄、乌喙最为凶毒,但良医以活人”的记载。医圣张仲景不仅开有毒中药辨证论治之先河,而且善用附子,每起沉疴,《伤寒论》载方113首,用附子之方达19首,主要用于回阳救逆、散寒止痛、温阳化气。明清医家沿习仲景之法,重用附子,治疗顽症,形成温阳学派,亦有称为“扶阳学派”或“火神派”。明代医家张景岳,将附子列为“药中四维”,作为治病保命的要药使用;清代“扶阳学派”的创始人郑钦安把附子作为“扶阳第一要药”;“火神派”医家祝味菊称附子为“百药之长”。经系统梳理含附子的方剂信息数据,发现涉及方剂3 915首、病证336种,由附子组成的上市中药成药有300多个,即有内服制剂,又有外用制剂、注射剂。但附子的毒性大、不良反应多,使用不当、毒性反应强烈。如汉末《名医别录》言:附子“味甘,大热,有大毒”;李时珍认为“乌附毒药,非危病不用”;近代名医恽铁樵亦云“最有用而最难用者为附子”。而欧州使用乌头酊剂治疗麻木和风湿病较久,且1973年英国药典已收录,但很少使用,美国亦如此;而中国、印度、日本、韩国、泰国、尼泊尔等亚州国家使用较为普通,引起中毒的报道较多,故1988年中华人民共和国国务院颁布了第23号令《医疗用毒性药品管理办法》,将生附子等28味中药列为毒性药品的管理范围。附子虽然毒性大,但疗效卓著,是临床常用的中药,历代主流本草和历版中国《药典》都将其收录。2015年版《中华人民共和国药典》附子项下收录盐附子、黑顺片、白附片、淡附片、炮附片,谓其“辛、甘,大热,有毒。归心、肾、脾经”,具有“回阳救逆,补火助阳,散寒止痛。用于亡阳虚脱,肢冷脉微,心阳不足,胸痹心痛,虚寒吐泻,脘腹冷痛,肾阳虚衰,阳痿宫冷,阴寒水肿,阳虚外感,寒湿痹痛”。附子的毒效关系密切,毒性与药效的靶器官多,主要靶部位一致。要科学揭示附子“毒效”的科学内涵,解读“药物-机体-应用”之间的多维关系,就必须按照“系统中药、多维评价、整合分析”的思路,研究附子毒效的科学内涵。

因此,我们从2000年以来,在国家973计划课题、国家自然科学基金重点项目、国家“十二五”科技支撑计划课题、国家发展改革委员会与国家中医药管理局“中药标准化项目”等国家项目的支持下,针对附子种质资源的多样性、化学成分的复杂性、药效作用的多向性、临床应用的广泛性,以“系统中药”为指导,提出并建立了“多维评价与整合分析”的方法,对附子的“品、质、制、性、效、用”进行了系统研究,基本阐明了附子不同空间分布、不同采集时间、不同煎煮时间、不同化学层次、不同给药剂量与效应之间的动态变化过程,基本揭示了中药附子“毒效”的物质基础、生物效应和增效控毒原理[16-17]。

品种研究:品种包括药材品种、炮制品种和中成药品种。附子为单基原植物,是毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaelii)的子根加工品,有4个亚型;附子的炮制品种有30多个,2015版《中华人民共和国药典》收载炮制品种5个[18];附子组成的中成药300多个,常见的有附子理中丸、金匮肾气丸、参附注射液等。我们项目组对附子的种质资源、遗传多样性、转录组与主要次生代谢产物、新品种培育、规范化种植、产地加工和主要炮制品、常用中成药进行了研究。

我们项目组已收集了全国11个省75个县的乌头块根活体标本,在成都中医药大学温江校区已经建立了附子的种质资源库和种植资源圃;研究了附子种质资源的染色体倍性遗传变异特性和乌头类多倍体形成机制,发现了存在不同染色体数量的附子资源类型,探讨了附子种质资源遗传多样性形成、变化的机制和特点;研究了附子植株生长周期内各主要器官的发生特点、生物量变化和物质累积动态规律,根、茎、叶、花、果发育建成的关键阶段,建立了主要性状生物量的生长曲线;揭示了生态因子、丰产技术与附子产量构成、药效物质的动态变化规律。尤其我们利用目前已收集到的乌头基因组DNA样本,使用第3代遗传标记技术——单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)[19],进行PCR扩增与核苷酸SNP测序,分析SNP频率、分布与特征,并构建了乌头种质遗传进化树。为探索附子植株的生物碱类次级代谢产物的合成途径以及基因调控信息,我们针对附子全植株进行了无基因组参考序列的RNA-Seq扫描测序及相应分析。使用乌头的子根(Lateral Root)、主根(Parent Root)、茎干(Stem)、叶片(Leaf)、全花(Flower)、全果(Fruit)等6个器官组织为材料,进行总RNA提取,通过Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq测序,总计产出2.357 29 e+10 nt数据。组装结果总Unigene 133 742个,总长129 872 479 nt,平均长度971 nt,N50达到1 576 nt。在乌头转录组的基因注释分析中,我们比较关注与生物碱的生物合成代谢相关的次生代谢通路及基因调控,主要是萜类、生物碱类、苯丙烷等代谢通路。通过KEGG分析,我们获得约1 500条与萜类代谢、2 800条生物碱与苯丙烷类代谢相关的核苷酸序列(图1)。我们利用乌头转录组数据,正逐步开展深入的信息挖掘,如将乌头地下部分根器官与地上部位器官进行代谢通路的比较分析,发现了4个与植物真菌感染相关的基因的转录表达活性发生了显著性差异、26个植物适应生境条件相关的信号转运与激素信号传导相关的基因发生了转录活性显著性差异(图2),这些经过筛选出的差异基因都具有极大的深入研究意义。

图1 主要次生代谢通路的核苷酸序列数量统计

注：A:Metabolism of terpenoids and polyketides;B:Biosynthesis of other secondary metabolites

图2 乌头地下地上部位转录组差异基因的代谢通路分析

我们研究了附子鹅掌叶、艾叶、南瓜叶泡杆、南瓜叶铁杆4个亚型的物质基础和生物效应,证明各亚型均可入药的科学依据;项目组先后培育附子新品种3个,其中川附2号、391-1因产量高、活性成分高、抗病性好,获得新品种证书,并由华润三九雅安药业与四川好医生药业在四川江油与四川布拖进行了规范化种植,并获得国家GAP认证;产地加工和炮制方面,首次制定了胆巴的辅料标准,对盐附子、黑顺片、白附片、淡附片、刨附片、炮天雄等炮制品种的炮制方法和增效解毒原理进行了研究,结果,黑顺片、白附片、淡附片、黄附片等毒性明显降低,刨附片、炮天雄几乎没有毒性;附子理中丸、金匮肾气丸等常用中成药,按传统方法制备后,毒性小、疗效好。

品质研究:品质即指中药固有的整体特性的质量,包括外在品质和内在品质两部分。附子不同的炮制品种,其外在品质不同,如盐附子以个大、体重、色灰黑、表面起盐霜者为佳,黑顺片以皮黑褐、切面油润有光泽者为佳,白附片以片大、色黄白、油润半透明者为佳,淡附片以气微,味淡,口尝无麻舌感。以切面油润有光泽者为佳。内在品质,主要包含遗传物质和药效物质。我们应用RAPD分子标记技术,研究了附子资源群体的遗传多样性,绘制了附子种质资源的指纹图谱;应用IR、TLC、HPLC、GC、CE、UV、HPLC-MS、GC-MS等现代技术,建立了附子药材、饮片、标准提取物、组分的化学库和指纹谱;比较研究了附子不同产地、不同炮制品、不同配伍药对、不同煎煮时间、不同提取环境毒效成分的变化,从而建立了附子在不同状态下的化学库和指纹谱;应用量子化学理论和Hyperchem结构分析软件,研究了乌头碱的热力学过程和构效关系,揭示了附子的物质基础和动态变化过程。结果,附子主要含生物碱、多糖、黄酮、芳香酸、甾醇、微量元素等。生物碱是目前附子中研究最多的化学成分,也是附子中较为特征的成分,主要包括C19型二萜生物碱类、C20型二萜生物碱类、酰胺类、季铵盐类、阿朴啡类等,C19型二萜生物碱数量最多,也一直被认为是附子的有效成分和毒性成分,《中华人民共和国药典》2015版规定了6种C19型二萜生物碱的检查和含量测定,分别为乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头碱和苯甲酰新乌头碱[18];我们从附子中分离了11个非二萜生物碱,主要包括嘧啶、吡啶、腺苷、吡咯和酰胺类[20-22]。现代研究,乌头碱、次乌头碱、新乌头碱是附子的主要毒性成分;去甲乌药碱、去甲猪毛菜碱、棍掌碱氯化物、附子灵、尼奥林、尿嘧啶、腺苷等具有强心作用;乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、去氧乌头碱等具有镇痛作用;附子多糖FPS-1等具有增强免疫功能的作用[23]。我们也比较研究了四川、陕西、云南、湖北等产地附子的指纹图谱,发现江油附子特有的指纹峰(见图3),证实道地药材的科学性。

图3 江油附子特有的指纹图谱

制药研究:主要包括药材产地加工、饮片炮制、提取工艺、制剂工艺、自动化生产等制药过程。我们以参附注射液为例,来阐述制药研究的主要环节[24]。1)产地加工与饮片炮制:附子的产地加工是降低附子毒性的重要手段之一,其传统加工中强调胆巴浸泡,胆巴的质量直接影响附子药材的质量,我们制定了胆巴的质量标准。参附注射液以黑顺片入药,我们对黑顺片的炮制工艺过程中胆巴浸泡、漂洗次数、蒸煮处理等每个工艺步骤的总生物碱、双酯型生物碱、单酯型生物碱、核苷类物质(尿苷、腺苷)、糖类物质(果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖)、无机盐离子、浸出物、灰分等指标的变化规律进行了研究,制订了黑顺片炮制工艺及工艺技术参数,既能保证附片的减毒存效,又能保证中药注射剂的质量。红参产地加工与炮制,即选好的参根剪去须根及支根,装入蒸笼中蒸2～3 min,先武火后文火,蒸至参根呈半透明时熄火,冷后取出晒干或烘干,我们项目组建立了鉴定红参药材的TLC法和近红外光谱法和人参皂苷、糖蛋白等成分含量测定方法,并建立了红参内控标准的指纹图谱。2)提取与制剂工艺研究:黑顺片的提取工艺是关系到参附注射液安全有效的重要因素。我们采用UV、HPLC、HPLC/MS、HPLC/ELSD等分析方法,深入研究黑顺片提取工艺中煎煮时间、煎煮次数、加水量等因素变化过程中水提液总生物碱、酯型生物碱和双酯型生物碱的量时曲线,在组分水平和分子水平上探讨煎煮时间、加水量对黑顺片化学成分谱(库)的生物碱成分及毒性关系,黑顺片成分与功效关系,揭示了传统水煎对黑顺片毒性成分的控制规律;通过黑顺片生物碱成分模拟水解分析,确定毒性成分的水解影响因素、水解产物和黑顺片提取的最佳时间。对红参提取时回流加醇时间、乙醇浓度、回流升温时间、冷却时间,各次回流液的醇度、体积,对浓缩时的蒸汽压力、真空度、浓缩时间、浓缩液的相对密度及温度,以及主要阶段的蛋白质、树脂、鞣质、草酸盐、钾离子、含量、热原、指纹图谱、微生物数及部分阶段的溶血、异常毒性进行研究,确定红参提取工艺。对参附注射液工艺中除淀粉、蛋白质、鞣质、树脂等高分子物质和除热原、灭菌工艺、内包材等进行研究,建立产品各阶段药物含量、指纹图谱等方面的质量控制方法。3)自动化生产与在线检测:应用网络控制技术、中药指纹图谱质量控制和近红外在线检测等技术,对参附注射液的生产自动控制系统的主要设备和主要技术参数进行研究,对工艺参数进行实时在线存储、传输、备份和反馈,通过红外在线自动监测仪和软系统对参附注射液生产线的监控点实现远程在线控制。

药性研究:药性是中药作用于机体的基本性质和特征的高度概括,是中药基本理论的核心,是中药区别于植物药和天然药物的显著标志。本项目根据附子辛、甘、大热,归心、肾、脾经,有毒的药性特点,进行了系统研究。结果:附子总生物碱可能是附子热性的主要有效组分,附子辛、甘、大热的药性,通过强心、温阳、抗炎、镇痛、散寒的生物效应得以表述;附子归心、肾、脾经,通过附子治疗阳虚心力衰竭大鼠、肾阳虚证小鼠、脾阳虚便秘大鼠和小鼠等动物模型得以证明;附子的毒性通过附子的基础毒性与毒作用机制研究得到证实。尤其我们按照国际ICH的规范,在GLP实验室,先后完成了附子、白附片、黑顺片、生川乌、制川乌、提取物或提取部位对正常动物或病证模型动物的急性毒性试验、长期毒性试验、安全药理试验、致突变试验和生殖毒性试验[25-26];应用全胚胎培养、细胞培养、流式细胞技术、膜片钳技术、基因芯片技术、慧星试验、放射配基结合分析、超微结构观察和放射免疫测定等方法,研究附子、川乌和附子、川乌的主要毒性成分乌头碱的毒作用机制;应用HPLC/MS/MS、GC/MS、HPLC/ELSD等分析技术,建立了乌头碱、新乌碱、次乌头碱在组织、血清、胆汁、尿液中化学成分测定方法及其代谢物的检测方法,进行了川乌、附子中生物碱的毒代动力学研究[27];尤其应用高内涵筛选分析附子及其成分对斑马鱼和原代或传代细胞[28]的毒性靶器官、靶细胞,发现:1)附子、川乌的有毒组分主要为酯性生物碱(乌头碱),毒性靶器官主要是心脏、神经、胚胎(见图4)。2)附子、川乌存在控毒组分,为水溶性生物碱和多糖,可以对抗酯性生物碱的毒性。3)细胞离子通道、亚结构、酶、受体等是乌头碱毒作用的靶点,其毒作用具量效、时效关系。

功效研究:功效是系统中药的核心和主体,是系统中药学区别于传统主流本草学、现代药理学的重要特征,是现代中药学的学科标志。我们根据附子回阳救逆、补火助阳、祛风除湿止痛的功效,先后创建了心阳虚心力衰竭、阳虚便秘、风寒湿痹动物模型,建立了肾阳虚证、痛证、炎证、虚寒证动物模型和心肌细胞、神经细胞、结肠间质细胞、生殖细胞模型,研究附子的功效作用。结果,附子能明显增加心阳虚衰大鼠心率,升高左室内压最大上升速率,降低左室内压最大下降速率;明显改善肾阳虚动物一般状态,升高体温,恢复体温昼夜节律性,显著延长肾阳虚动物低温游泳衰竭时间和爬杆时间;明显改善阳虚便秘小鼠和大鼠的阳虚便秘症状,显著缩短排便潜伏期,增加排便颗粒数,明显促进胃肠蠕动,提高胃肠推进率[29];能有效治疗风寒湿痹动物模型,能明显抑制二甲苯所致小鼠耳郭肿胀,显著对抗蛋清所致大鼠足跖肿胀,抑制巴豆油所致大鼠炎性肉芽肿的增生,减少炎性渗出液;能显著减少醋酸所致小鼠扭体次数,延长小鼠扭体潜伏期,明显延长热板刺激小鼠添后足潜伏期,提高热板小鼠痛阈值;并通过不同结构层次发挥功效机制。尤其,我们根据附子对证用药的规律,研究了不同炮制品种(生附子、盐附子、白附片、黑附片、生川乌、制川乌、刨附片、炮天雄)[30]、不同煎煮时间(15 min、30 min、60 min、120 min、3 h、4 h、6 h)、不同给药剂量(相当于临床人用量3 g/60 kg/d的1、3、6、12、24、36、48、72、96、120倍)[31]、不同配伍药对(附子配伍甘草、干姜、大黄、人参、厚朴、黄连,制川乌配伍白芍)增效解毒的机制[17]。结果:1)附子的主要药效靶器官是心脏、神经、胚胎。2)生附子、生川乌煎煮时间短、剂量大,毒性强;煎煮时间长、剂量小,毒性低;煎煮时间达6 h,无明显毒性。附子、川乌炮制后,毒性明显降低;刨附片、炮天雄几乎无毒[32]。附子配伍甘草、干姜、大黄、人参、厚朴、黄连,制川乌配伍白芍,具有明显的增效解毒作用。

图4 乌头碱毒性对心脏、神经、胚胎的作用

应用研究:中药临床应用主要包括配伍、用法、用量、使用注意等方面的内容。本项目组在中医药理论指导下,主要系统研究了附子正品药材、依法炮制、对证用药、合理配伍和不同给药剂量、煎煮时间对化学物质、毒性反应、药效作用的影响,为临床安全合理用药提供了科学依据。1)正品药材:项目组应用现代药学技术建立了附子的化学库、指纹谱和煎煮系统中酯型生物碱含量的变化,选择正常动物和病证动物模型,比较研究了不同来源品种药材在发挥解热、抗炎、镇痛和温阳功效时的毒性和药效作用[33],以及对体外原代心肌细胞、海马神经元细胞的毒效强度,结果显示,品种不同,其毒效物质基础和强度存在差异,以正品药材、道地产区药材质优效佳。2)依法炮制:项目组应用现代药学技术建立了附子不同炮制品的化学库、指纹谱,选择正常动物及炎性反应动物模型、疼痛动物模型[34]、痹证动物模型、寒证动物模型、心力衰竭动物模型、阳虚便秘动物模型,研究了不同炮制品增效减毒的作用及作用原理。结果,炮制具有明显的减毒作用。3)对证用药:项目组从附子的功效特点出发,选用小鼠耳郭肿胀模型、大鼠足跖肿胀模型、大鼠肉芽肿模型、疼痛动物模型、寒证动物模型、痹证动物模型、心力衰竭动物模型、阳虚便秘动物模型、热证动物模型,研究生附子、黑顺片、白附片等对不同病证模型的毒性和药效,通过正交设计得到不同的优化配比,结果发现,对证用药能控毒增效。4)合理配伍:从附子的临床应用出发,选择常用药对附子(盐附子、黑顺片、白附片)配伍干姜、甘草、大黄、人参,从饮片配伍、组分配伍和成分配伍3个层次,一方面采用药学检测技术方法,研究了配伍前后对附子总生物碱、酯型生物碱和双酯型生物碱含量的变化,另一方面,选用炎性反应动物模型、疼痛动物模型、痹证动物模型、寒证动物模型、心力衰竭动物模型、阳虚便秘动物模型,研究附子配甘草、附子配干姜、附子配人参、附子配大黄的解毒增效作用原理,筛选其有效组分、毒性组分、控毒组分,以及各组分配伍的最佳比例。结果发现,附子存在毒性组分和控毒组分,通过配伍,可以减少毒性组分的含量,降低毒性,且增加疗效。并通过此研究发现了治疗心力衰竭、便秘、类风湿关节炎的有效组分和有效组分最佳配伍比例。5)延长煎煮时间:通过比较不同煎煮时间下附子总生物碱、酯型生物碱和双酯型生物碱的含量变化和乌头碱的水解规律,应用炎性反应动物模型、疼痛动物模型、痹证动物模型、寒证动物模型、心力衰竭动物模型、阳虚动物模型,观察不同煎煮时间、不同给药剂量下的毒性和药效,结果发现,附子可通过延长煎煮时间降低毒性,也证实了此类中药在传统应用中“先煎”“久煎”的科学性。

我们通过对附子毒效的多维(品质制性效用)评价和组学(基因组、蛋白组、代谢组、细胞组)研究,发现:1)附子毒效关系密切,主要毒性靶器官和药效靶部位为心脏、神经、胚胎;2)附子存在毒效相反的两类物质,一类为毒性物质——二萜类生物碱等,另一类为药效物质——非二萜类生物碱成分。附子的毒性物质基础与药效物质基础在不同的状态下是可以发生转化的,如二萜类生物碱是毒性物质基础,但发挥抗炎止痛作用时,又是药效物质基础,二萜类生物碱水解后又可转换为药效物质。3)附子不同的产地、不同的炮制品种、不同的制备方法、不同的配伍方式,针对机体不同的疾病状态,不同的靶器官、靶细胞、靶分子,其物质基础和毒效作用机制是不同的,“附子-机体-应用”之间具有复杂的网络关系。

网络药理学、系统毒理学和组学是目前解析复杂网络的思路和方法,为附子的多维关系的整合分析提供了有效的途径。我们进一步研究的思路是:应用网络药理学、系统毒理学和组学等多学科的技术和手段,整合研究附子“药物(药材-饮片-组分-成分)-机体(整体-靶器官-靶细胞-靶分子)-应用(道地药材-依法炮制-制备方法-对证用药-合理配伍-剂量疗程)”的多维关系,揭示附子的“毒效物质基础-毒效作用机制-控毒增效原理”,明确附子的阈剂量、半数有效剂量、半数致死剂量、毒作用带、治疗指数和安全限度,破解中药“毒-效”研究的难题,为中药“毒-效”多维评价和整合分析研究提供示范。见图5。

图5 附子“毒-效”多维评价和整合分析研究示意图

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ThoughtandPracticeofMultidimensionalEvaluationandIntegratedAnalysisonToxicityandEfficacyofRadixAconitiLateralisPraeparata

Peng Cheng

(CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine;KeyLaboratoryofChineseHerbsStandardizationofMinistryofEducation;Co-constructKeyLaboratoryofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicinalResources,Chengdu611137,China)

Currently, the safety and efficacy of Chinese materia medica have been questioned. Encountering that situation, this paper systematically elaborated on the cognitive process and basic connotation of the toxicity and efficacy of Chinese materia medica. A new thought and methodology of “multidimensional evaluation and integrative analysis of the toxicity and efficacy of TCM” was proposed. Taking Radix Aconiti Lateralis Praeparata as an example, the breeds, quality, pharmaceutical manufacture, medicinal properties, medicinal effects, and application of Radix Aconiti Lateralis Praeparata were used to evaluate the toxicity and efficacy systematically. Furthermore, the material basis, mechanism, and principle of effect-enhancing and toxicity-reducing of Radix Aconiti Lateralis Praeparata were integrated analyzed.

Radix Aconiti Lateralis Praeparata; Toxicity and efficacy; Multidimensional evaluation; Integrated analysis

国家自然科学基金重点项目(81630101);国家发改委标准化项目(ZYBZH-C-SC-51);国家自然科学基金国家基础科学人才培养基金(J1310034);四川省中医药管理局“川产道地药材综合开发与区域发展”项目(2016ZY008)

彭成(1964.03—),男,博士,教授,博士研究生导师,研究方向：中药毒效的系统评价与整合研究,E-mail:pengchengchengdu@126.com

R285.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.001

(2017-10-09收稿 责任编辑：王明)