甘加藏羊发情周期不同阶段血浆生殖激素分泌规律

朱雪雁，葛闻博，何玉琴* ，史军红，王文芳

(1.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州730070; 2.甘肃农业大学 生命科学技术学院，甘肃 兰州730070)

甘加藏羊发情周期不同阶段血浆生殖激素分泌规律

朱雪雁1，葛闻博2，何玉琴2*，史军红2，王文芳2

(1.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州730070; 2.甘肃农业大学 生命科学技术学院，甘肃 兰州730070)

为研究甘加藏羊发情周期血浆中生殖激素的分泌变化规律，选取24只处于发情周期内的甘加藏羊，采集甘加藏羊发情周期不同阶段的血液，采用酶联免疫分析法(ELISA)检测甘加藏羊发情周期血浆中促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、孕酮(P)和雌激素(E)的分泌变化。结果显示，FSH含量在发情期最高，为3.406 mIU/mL，发情后期降低至2.492 mIU/mL，间情期又开始升高，至发情前期达2.727 mIU/mL，发情期含量极显著高于发情后期、间情期和发情前期；LH含量在间情期最高，为4.377 mIU/mL，发情后期显著低于间情期和发情前期；P含量在发情前期最高，为 18.039 ng/mL，发情期降至16.196 ng/mL，发情后期缓慢升高，间情期达17.127 ng/mL，发情前期极显著高于发情期与发情后期；E含量在发情前期最低，为29.625 pg/mL，发情期升高(36.035 pg/mL)，发情后期达到最高，为38.573 pg/mL，间情期又降低(35.531 pg/mL)，发情后期极显著高于发情期、间情期以及发情前期，发情期与间情期极显著高于发情前期。

甘加藏羊； 发情周期； 促卵泡素； 促黄体素； 孕酮； 雌激素； ELISA

高原甘加藏羊是青藏高原特有畜种，为典型季节性发情哺乳动物，每年产羔1次，每胎1羔[1]，低繁殖率严重影响了甘加藏羊养殖产业的快速发展。生殖激素的变化直接调控着母畜的发情、排卵等生殖过程[2-5]。因此，生殖激素的生理分泌规律研究一直被国内外学者所关注，有关发情周期中鹅[6]、牦牛[7]、猪[8]和羊[9-10]等动物生殖激素的变化研究较多，但由于甘加藏羊生活环境条件差，现场采样及试验比较因难，有关甘加藏羊发情周期生殖激素的生理分泌规律研究较少[11-14]。鉴于此，在繁殖季节对甘加藏羊发情周期血浆中促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、孕酮(P)和雌激素(E)4种激素含量进行测定，以探讨甘加藏羊在发情周期生殖激素的变化规律，为研究甘加藏羊的生殖生理和同期发情处理等提供理论依据，为提高甘加藏羊繁殖率研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 样品采集

2015年7月初—9月底，在甘肃省甘南藏族自治州夏河县甘加乡高寒草原(海拔3 800 m)夏季牧场某羊场，随机选取24只年龄2.5 ～ 4岁、体质量32 ～ 42 kg、健康未孕雌性甘加藏羊，供试羊在牧场散放饲养，自由采食、饮水。连续观察2个发情周期(36 d左右)后开始试验。根据公羊爬跨和阴道涂片法鉴定发情[13]。按发情周期的不同阶段分为发情期(0～36 h)、发情后期(39～72 h)、间情期(第4天早上～第13天晚上)、发情前期(第14天早上～第16天晚上)4组(下同)，每组各6只，采用颈静脉采血。公羊爬跨时记为发情第0 h；发情期第0～36 h，每2 h采1次血；发情后期第39～72 h，每3 h采1次血；间情期和发情前期每天7:00、19:00 各采血1次；每次颈静脉采血5 mL，连续采集2个发情周期(15～17 d)。血样经肝素钠抗凝后，以1 000×g 离心10 min，移入预先标记好的洁净血浆管中，放入-20 ℃冰箱内保存待测。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 主要试剂 FSH、LH、P和E的ELISA 检测试剂盒，均购于北京奇松生物有限公司。

1.2.2 主要仪器 酶标仪(型号Multiskanmk 3)购自赛默飞世尔科技有限公司，高速冷冻离心机由德国Eppendorf公司生产，10～1 000 μL移液器购自Therom 公司，电热鼓风干燥箱由上海鸿都电子科技有限公司生产，恒温水浴锅购自江苏淮阴医疗器械厂，低温冰箱购自青岛海尔公司，高压灭菌锅购自中远机械有限公司。

1.3 生殖激素的测定

采用ELISA法测定血浆中FSH、LH、P和E的OD值。根据各自标准品的OD值以及相对应的含量绘制标准曲线，得到回归方程。FSH的回归方程为y=4.892x-0.52，LH的回归方程为y=9.483x-0.384，P的回归方程为y=31.232x-6.505，E的回归方程为y=55.796x-2.462，其中，y代表含量，x代表OD值。根据各自的回归方程计算出每种激素不同样品的含量，并进行分析。

1.4 数据处理

所有数据以平均数±标准差表示，用 SPSS 19.0软件处理，统计血浆中FSH、LH、P、E的含量及其波动周期，并用t检验分析。

2 结果与分析

2.1 甘加藏羊发情期和发情后期血浆中FSH和LH含量的变化

由图1和图2可知，甘加藏羊在发情期(0～36 h)至发情后期(39 ～ 72 h)，血浆中FSH、LH分泌既有脉冲式分泌，又有波动式分泌。FSH在发情期呈脉冲式及波动式分泌，LH在发情期均为波动式分泌；FSH和LH在发情后期呈脉冲式分泌。FSH在发情期和发情后期出现4个明显的峰值，分别在发情后第2 h(3.602 mIU/mL)、8 h(3.601 mIU/mL)、34 h(3.739 mIU/mL)和第51 h(3.712 mIU/mL)；LH在发情期出现3个峰值，分别在发情后第12 h(4.584 mIU/mL)、24 h(4.389 mIU/mL)和第36 h(4.439 mIU/mL)。在发情期和发情后期，FSH、LH均是发情时升高，之后第8～34 h,FSH在3.041～3.739 mIU/mL波动，第36～72 h平均含量为2.582 mIU/mL，呈现下降趋势。LH在发情期与发情后期的整体平均分泌量为4.034 mIU/mL，明显高于FSH同期的平均分泌量(2.950 mIU/mL)。

图1 甘加藏羊发情期FSH、LH含量变化

图2 甘加藏羊发情后期FSH、LH含量变化

2.2 甘加藏羊间情期和发情前期血浆中FSH、LH含量的变化

由图3可知，甘加藏羊间情期(第4天早上～第13天晚上)及发情前期(第14天早上～第16天晚上)血浆中FSH、LH呈现一定的分泌规律。间情期FSH呈波动式分泌，LH既有波动式又有脉冲式分泌；发情前期FSH、LH均呈脉冲式分泌。在间情期和发情前期，FSH出现2个明显的峰值，分别在第6天早上(3.527 mIU/mL)、第15天早上(3.489 mIU/mL)；LH出现3个明显的峰值，分别在第4天早上(5.655 mIU/mL)、第9天晚上(4.645 mIU/mL)和第16天早上(4.927 mIU/mL)。FSH后2个峰值出现的时间均早于LH峰值出现的时间；FSH和LH的分泌趋势相似，但LH在间情期与发情前期整体分泌水平(4.376 mIU/mL)明显高于同时期FSH的整体分泌水平(2.672 mIU/mL)。

dz表示一天的早上，dw表示一天的晚上，图6同

2.3 甘加藏羊发情期和发情后期血浆中E和P含量的变化

由图4和图5可知，甘加藏羊在发情期(0～36 h)和发情后期(39～72 h)，E和P均呈波动式分泌。在0～72 h之内，E出现2个明显的峰值，分别在第0 h(40.966 pg/mL)和第51 h(41.710 pg/mL)；P出现了3个明显的峰值，分别在第10 h (18.985 ng/mL)、24 h (18.738 ng/mL)和第36 h (22.629 ng/mL)。在甘加藏羊的发情期和发情后期，E分泌的动态变化为发情第0 h最高(40.966 pg/mL)，随后下降至第2 h的33.224 pg/mL，4～48 h含量在33.06 ～ 39.408 pg/mL小幅度波动，51～72 h 的平均含量为38.914 pg/mL，显著高于4～48 h 的平均含量(36.287 pg/mL)(P<0.05)，呈上升趋势；P在发情期的含量较低，平均含量为16.196 ng/mL，发情后期开始升高，平均含量为16.831 ng/mL。

图4 甘加藏羊发情期E、P含量变化

图5 甘加藏羊发情后期E、P含量变化

2.4 甘加藏羊间情期和发情前期血浆中E和P含量的变化

由图6可知，甘加藏羊在间情期(第4天早上～第13天晚上)E和P的分泌方式不同，E为波动式分泌，P既有波动式又有脉冲式。在发情前期(第14天早上～第16天晚上)二者均为波动式分泌。在间情期和发情前期内，E出现了1个波峰，在第11天(53.778 pg/mL)；P 的2个波峰分别出现在第4天(19.156 ng/mL)、第11天(24.399 ng/mL)。在甘加藏羊间情期和发情前期，E在第4天晚上开始下降，含量为39.671 pg/mL，第7天达到最低值(23.756 pg/mL)，之后开始上升，于第11天早上达到最高值(53.778 pg/mL)，之后又开始下降，至第15天晚上降低至27.463 pg/mL，之后缓慢上升；间情期P继续升高，平均含量为17.127 ng/mL，在发情前期达到最高，平均含量为18.039 ng/mL，在发情前期后期P含量下降，于第16天晚上降至最低值(17.031 ng/mL)。

图6 甘加藏羊间情期与发情前期E、P含量变化

2.5 甘加藏羊发情周期FSH、LH、E和P含量变化的比较

由表1可知，FSH含量在发情期最高，为3.406 mIU/mL，发情后期降低至2.492 mIU/mL，间情期又开始升高，至发情前期达2.727 mIU/mL，发情期含量极显著高于发情后期、间情期和发情前期；LH含量在间情期最高，为4.377 mIU/mL，发情后期显著低于间情期和发情前期；P含量在发情前期最高，为 18.039 ng/mL，发情期降至16.196 ng/mL，发情后期缓慢升高，间情期达17.127 ng/mL，发情前期极显著高于发情期与发情后期；E含量在发情前期最低，为29.625 pg/mL，发情期升高(36.035 pg/mL)，发情后期达到最高，为38.573 pg/mL，间情期又降低(35.531 pg/mL)，发情后期极显著高于发情期、间情期以及发情前期，发情期与间情期极显著高于发情前期。

表1 甘加藏羊发情周期血浆FSH、LH、E和P含量的变化

注：同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

3.1 甘加藏羊发情周期FSH和LH的分泌变化特点

甘加藏羊的发情周期中，FSH发情期分泌量最高，之后开始降低，发情后期与间情期在一定范围内波动，发情前期又开始升高；LH是发情期升高，发情后期降低，间情期开始升高。由此可知，FSH和LH分泌趋势基本一致，与FSH、LH的生理作用(FSH刺激卵泡生长发育，LH促进卵泡成熟以及排卵)是相符合的，这与火静萍等[14]的研究结果一致。本研究还发现，甘加藏羊在发情周期中LH的平均分泌水平(4.205 mIU/mL)明显高于FSH平均分泌水平(2.810 mIU/mL)，这与前人[15]在奶牛上对于血浆中FSH和LH分泌特点的研究结果一致。

3.2 甘加藏羊发情周期血浆中FSH和LH含量的变化与其发情周期垂体组织中FSH、LH mRNA表达的关系

FSH和LH是由垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的促性腺激素。史军红等[11]报道，在高原甘加藏羊发情周期不同阶段，垂体组织中FSHβ mRNA的表达量间情期最高，与发情前期差异极显著(P<0.01)；LHβ mRNA的表达量发情后期最高，与发情期、发情前期、间情期差异均极显著(P<0.01)。在本研究中，甘加藏羊发情周期血浆中 FSH发情期升高，发情后期开始下降，间情期与发情前期上升，并在发情期达到最高，这比垂体组织中FSHβ mRNA在间情期的最高表达量出现的时间晚；发情周期血浆中LH含量在发情后期慢慢下降，在间情期开始上升，稍滞后于垂体中LHβ mRNA的表达。垂体分泌的FSH、LH进入血液中，通过血液循环到达靶器官，作用于卵巢上的FSHR、LHR(促卵泡素和促黄体素的受体)，促进卵泡发育以及成熟排卵，血浆中FSH和LH含量达到最高值时期迟于垂体组织中FSHβ、LHβ mRNA表达量最高值的出现时期，其原因有待进一步研究。王文芳等[12]报道，甘加藏羊在发情周期中，卵巢组织中FSHR mRNA的表达量发情期最高，LHR mRNA的表达量发情后期最高，这与本研究中FSH峰值的出现早于LH峰值出现的时间相一致。

3.3 甘加藏羊发情周期内P和E 的分泌变化规律

徐直等[16]报道，黑白花奶牛发情周期中P含量全周期变化不大，发情时低，为2.70 ng/mL，第8～12天形成台状峰(3.01～3.63 ng/mL)，第15天再出现1个峰，之后下降；E含量全周期处于低水平，发情后第12 h最高(23.23 pg/mL)，之后下降,分别至第5天、第9天升高，出现2个峰。本研究中，在甘加藏羊发情周期中，发情期时P的平均含量(16.196 ng/mL)最低，排卵后逐渐上升，在发情后第11天早上即黄体期达到最大值(24.399 ng/mL)，之后逐渐下降，这与徐直等[16]的报道基本一致，也与P的生理功能相符合。发情母畜排卵后形成了黄体，黄体会分泌P来维持妊娠，如果发情母畜排卵后没有受精的话，黄体就会自动溶解，使母畜进入下一个发情周期。

E含量在发情前期最低，为29.625 pg/mL，发情期升高(36.035 pg/mL),发情后期达到最高，为38.573 pg/mL，间情期又降低(35.531 pg/mL)，发情后期极显著高于发情期、间情期以及发情前期，发情期与间情期极显著高于发情前期。

3.4 甘加藏羊发情周期血浆中4种激素的相互关系及其对生殖活动的调控

发情前期FSH平均含量处于较高水平(2.727 mIU/mL)，可以促进卵泡生长发育；LH在发情前期平均含量为4.375 mIU/mL，有助于刺激卵泡发育成熟，与FSH协同促进卵泡的发育以及成熟；在发情前期黄体开始溶解之前，因为黄体持续的分泌使P的平均含量达到最高(18.039 ng/mL)；E含量在发情前期呈缓慢上升的趋势，此时E对下丘脑的促性腺激素释放和垂体的促性腺激素的分泌以及释放呈正反馈的作用，有助于刺激卵泡发育。葛仕豪等[17]认为，在排卵前，卵泡中颗粒细胞不但合成大量的E，也合成少量的P，成熟卵泡分泌大量的E，在排卵前达高峰，可激发LH和FSH出现波峰，LH的峰值称为排卵峰。发情后期动物机体已完成排卵，黄体逐渐形成，P含量开始升高，FSH分泌下降，这是因为此时P抑制了垂体释放FSH进而抑制动物发情[2]。血清FSH和LH的含量在进入发情期后会出现升高趋势，其中绵羊在发情期的第12天垂体 FSH 和 LH 的含量最高，而在发情期或怀孕后期明显下降[18-19]。甘加藏羊在间情期，P合成量剧增，从而维持妊娠，FSH和LH分泌量开始升高，为下一波卵泡的发育及成熟做准备。

[1] 张前中,包永清,何文,等.甘加羊种质特性[J].中国草食动物,2008,28(3):66-67.

[2] 杨增明,孙青原,夏国良.生殖生物学[M].北京:科学出版社,2005:13-24.

[3] 王一涵,田秀娥,江中良,等.GnRH及其类似物在动物繁殖中的应用概述[J].中国兽医杂志,2013,49(3):89-92.

[4] 徐元青,王建林,邵宝平.促性腺激素释放激素(GnRH)结构及调控的研究进展[J].畜牧与饲料科学,2014,35(12):31-33.

[5] 吕慎金,刘兆斌.促性腺激素释放激素(GnRH)及其Ⅰ型受体在哺乳动物中的研究进展[J].中国农业大学学报,2013,18(4):147-154.

[6] 陈秀萍,姜勋平,丁家桐.鹅卵泡颗粒细胞凋亡及其与生殖激素间的关系[J].畜牧兽医学报,2006,37(10):982-986.

[7] 薛立群.牦牛发情周期和妊娠早期乳脂孕酮水平的变化[J].畜牧兽医学报,1983,14(3):29-32.

[8] 杨勇军,郭顺元.高原环境下母猪性发育与周期外周血中生殖激素水平[J].中国兽医学报,2001,21(2):188-191.

[9] 姜怀志,李向军,戢爽,等.辽宁绒山羊母羊FSH全年分泌规律的研究[J].中国畜牧杂志,2008,44(15):15-17.

[10] 葛仕豪.济宁青山羊血清Ghrelin与主要生殖激素质量浓度变化的关系[J].中国兽医科学,2015(2):217-220.

[11] 史军红,何玉琴,葛文博,等.高原甘加藏羊发情周期垂体FSHβ和LHβmRNA表达差异的研究[J].中国兽医科学,2016(11):1444-1449.

[12] 王文芳,何玉琴,韩志磊,等.高原甘加型藏羊发情周期不同阶段卵巢FSHR和LHR基因表达差异的研究[J].中国兽医科学,2016(1):97-103.

[13] 韩志磊,史军红,何玉琴,等.甘加型藏羊发情周期阴道细胞变化规律[J].中国兽医学报,2016,36(7):1241-1246.

[14] 火静萍,何玉琴,韩志磊,等.甘加藏羊发情周期血浆FSH和LH的分泌规律[J].中国兽医学报,2016,36(6):1053-1058.

[15] Fleming J S,Greenwood P J,Heath D A,etal.Expression of gonadotrophin subunit genes in sheep that were homozygous carriers and non-carriers of the Booroola fecundity geneFecB[J].J Reprod Fert,1995,103:315-321.

[16] 徐直,蒋振国,徐一树, 等.黑白花奶牛发情周期血液中促卵泡素、促黄体素、促乳素、孕酮、雌二醇的浓度及变化规律[J].华北农学报,1996,11(3):121-127.

[17] 葛仕豪,高立坤,王树迎,等.济宁青山羊发情周期内促性腺激素和性激素分泌规律的研究[J].西南农业学报,2007,20(6):1348-1352.

[18] 祝晓丽,许惠艳,刘晓华,等.广西沼泽型母水牛发情淡季生殖激素变化规律的研究[J].安徽农业科学,2012,40(5):2721-2723.

[19] 高利华,马国辅,夏远方,等.小梅山猪性发育过程中生殖激素的变化规律[J].江苏农业科学,2013,41(9):176-178.

Dynamics Research of Reproductive Hormone Secretion in the Plasma of Ganjia Tibetan Sheep in Different Stages of Estrous Cycle

ZHU Xueyan1,GE Wenbo2,HE Yuqin2*,SHI Junhong2,WANG Wenfang2

(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China; 2.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

To study the secretion changes of reproductive hormones in Ganjia Tibetan sheep estrous cycle in plasma, the blood of different estrous cycle stages from 24 Ganjia Tibetan sheep was collected and the secretion dynamic change of follicle-stimulating hormone(FSH),luteinizing hormone(LH),progesterone(P) and estrogen(E) in plasma of the Tibetan sheep estrous cycle was tested by enzyme-linked immunoassay(ELISA).The results showed that content of FSH was the highest(3.406 mIU/mL)in the estrus,then reduced to 2.492 mIU/mL in the late estrus and began to rise in the dioestrus,and achieved 2.727 mIU/mL in the proestrus.The content of FSH in the estrus was significantly higher than that of the late estrus,dioestrus and proestrus.The content of LH in the dioestrus was the highest (4.377 mIU/mL), and the late estrus was significantly lower than dioestrus and proestrus.The content of P was the highest (18.039 ng/mL) in the proestrus,then reduced to 16.196 ng/mL in the estrus and rose slowly in the late estrus (achieved to 17.127 ng/mL in the dioestrus).The content of P in the proestrus was significantly higher than that of the estrus and the late estrus.The content of E was the lowest(29.625 pg/mL) in proestrus,rose to 36.035 pg/mL in the estrus and achieved to the highest in the late estrus(38.573 pg/mL),then reduced to 35.531 pg/mL in the dioestrus.The content of E in the late estrus was significantly higher than the estrus,dioestrus and proestrus,and that of proestrus was significantly lower than dioestrus and estrus.

Ganjia Tibetan sheep; estrous cycle; FSH; LH; P; E; ELISA

S852.21

A

1004-3268(2017)11-0138-06

2017-06-06

国家自然科学基金项目(31360595)

朱雪雁(1991-)，女，河南新乡人，在读硕士研究生，研究方向：基础兽医学。E-mail:957234280@qq.com

*通讯作者：何玉琴(1963-)，女，甘肃兰州人，教授，博士，主要从事动物生理学与发育生物学的教学与研究工作。

E-mail:894293529@qq.com