小鼠急性心梗模型建立学习曲线及专业实验技能培养

赵璧君，谭延振，杨 剑，金振晓，熊红燕，俞世强

·教学训练·

小鼠急性心梗模型建立学习曲线及专业实验技能培养

赵璧君，谭延振，杨 剑，金振晓，熊红燕，俞世强

目的总结本实验室建立小鼠急性心肌梗死模型的学习曲线，实验室技术人员在医学研究生培养中的作用。方法4名有理论基础无外科基础实验室技术人员，进行小鼠急性心肌梗死模型建立的培训，从术前死亡率、冠脉结扎准确度及模型建立所需时间及稳定性角度进行评价。结果经过至少1个月培训，可以将术前小鼠死亡率降低至合理范围(小于5%)；经过至少六个月训练，心肌梗死模型可以在(20±2)min完成，稳定性较好[四周后，左室射血分数为(18±2)%]。结论实验室技术人员在研究生培养中起到重要作用，尤其是一些对时间、技能要求较高的平台型技术，更是不可或缺。

实验室；技术人员；小鼠模型；急性心肌梗死

实验室是医学研究的重要开展场所，是研究生进行课题研究的重要基地。实验室除了研究生，往往还有实验室技术人员，他们肩负协助研究生完成课题、协助课题负责人实施课题和实验室管理等任务。作为具有一定科研经历的技术人员，他们在研究生培养中起到不可或缺的作用[12]。训练有素的专职技术人员，能从科研态度、科研思维及实际动手能力等方面对研究生产生积极影响，将涉及科研的经验教训及实践经验传授给研究生，使其少走弯路。而缺乏专职技术人员时，研究生往往不得不在实验操作细节上花费大量时间，以至于耽误课题进展[1]。

小鼠急性心肌梗死/心肌缺血再灌注模型是心血管内外科和循环病理生理学实验室常用的动物模型，通过对冠状动脉左前降支进行结扎(心肌缺血)或结扎再松开(心肌缺血再灌注)实现。该模型难点在于：①小鼠心脏表面可见血管全是静脉，所要结扎的动脉均走行于肌肉中，难以目视，只能凭借左心耳、心尖等部位凭经验大致确定，准确找到冠状动脉所在位置较为困难；②该模型所造成的心肌损伤与结扎相对位置直接相关，为保证结果准确可靠，必须保证每次所扎位置一致，而结扎位置需要凭经验确定，所以这也是缺血模型的一个难点。本文简要总结了本实验室4名技术人员训练和掌握这一专用动物模型的学习曲线，以期为心血管内外科研究生培养和专业技术人员的训练提供参考。

1 材料与方法

1.1材料 无特定病原(SPF)级雄性健康C57BL/6J小鼠，体重约20 g，8周龄，购买于空军军医大学动物中心，普通喂养。

1.2参加培训人员 本研究室固定工作人员四名，均已获得医学及相关专业硕士学位，对本研究涉及器官、组织解剖结构熟悉，无小动物实验经验。

1.3小鼠心肌梗死模型建立训练 小鼠心肌梗死模型建立训练分三部分进行：气管插管、开胸及模型建立。

1.3.1气管插管训练 对小鼠进行称重后，通过腹腔注射按照400 μl/20 g体重给予25 mg/ml的2,2,2-三溴乙醇。待小鼠麻醉，固定于手术台，脱去胸部左前区毛，连接心电监护仪，检测小鼠心电活动。小鼠头部朝向操作者，光源照射颈部凹陷以下位置，用镊子轻轻夹住舌头，用压舌板轻压舌根，可以看到一个明显亮的圆点，另一手持软导管轻轻送入，完成气管插管，连接呼吸机。记录一次插管成功率。

1.3.2开胸训练 从左肋第3/4肋间，剪开皮肤，外层肌肉由内向外斜着打开，内层肌肉由外向内斜着打开，使用拉钩，将开口固定好，打开心包膜，暴露心脏，从显微镜下观察，看以看到鲜红的冠脉。然后缝合，记录小鼠死亡率。

1.3.3模型建立训练 用6-0丝线在小鼠冠脉左前降支距根部2～3 mm处打外科结造成心肌梗死。挤出胸腔内空气，将肌肉依次缝合，最后将皮肤缝合。等待小鼠有自主呼吸以后，撤掉呼吸机。待小鼠清醒后，正常饲养4周。记录所需时间及准确率。通过伊文氏蓝染色和心脏功能测定评价模型建立稳定性。

1.4小鼠心脏伊文氏蓝染色 在麻醉状态下，从左心室腔注入伊文氏蓝(1%)1～2 ml。迅速摘取心脏，冻存于-20℃。该部分由是操作熟练专人完成。

1.5小鼠心脏功能测定 小鼠放入小动物气体麻醉机，给予含有2%异氟烷的氧气进行吸入麻醉，使用脱毛膏进行胸前区脱毛。脱毛后，利用Vevo770小动物超声仪(VisualSonics，Toronto，Canada)检测小鼠心脏功能。使用仪器自带软件通过测量收缩及舒张期时，心肌厚度计算小鼠心脏左室射血分数(ejection fraction，EF)。该部分由是操作熟练专人完成。

2 结 果

2.1小鼠手术前准备训练 本研究采用的是开胸方式进行模型制备，在开胸前，需要进行气管插管。由于在模型建立后，还需要再喂养四周，所以气管插管宜采用直视法，将插管直接送入气管(图1 A)。经过一周气管插管训练，一次成功率显著提高(图1 B)。在研究初期，由于操作不熟练，器械会多次造成肺损伤或者引发心脏停跳，导致小鼠死亡。经过1周的开胸训练，可以将小鼠手术前的死亡率显著下降(图1 C)，可以稳定的控制在5%以下。

2.2准确结扎冠状动脉左前降支 小鼠冠状动脉走行于心肌组织中，很难准确判断其准确位置。为准确结扎冠脉，需要进行专门的训练。采用6-0丝线结扎之后，从左心室注入1%伊文式蓝，结扎正确时，心脏被染成蓝色，而左心室部分不会被染成蓝色；不正确时，整个心脏都是蓝色或者非左室区域不被染成蓝色。经过一个月的训练，准确率提高明显(P<0.05)，从第一周的(70±10)%升高到(94±2)%(图2)。

2.3模型建立熟练程度及稳定性 在能够熟练完成气管插管、打开胸腔并暴露心脏及准确结扎在冠脉位置后，进一步进行培训。目的是提高模型的稳定性及缩短模型建立所需的时间。模型建立的时间包括小鼠麻醉后固定于手术台、插管、开胸、结扎及关胸缝合等一系列操作。经过为期半年的培训，参加培训的人员基本都可以将所需时间从最初的(50±8)min缩短到(20±2)min(P<0.05)，这与文献结果相似[3]。小鼠进行心梗手术后饲养四周，通过小动物心脏超声，计算EF后，计算组内EF%的误差，评估模型的稳定性，稳定性明显提高(P<0.05)：从第一个月心脏超声EF值(28±10)%降低到(18±2)%，说明心梗模型稳定性较好[4-5]。见图3。

注： A 小鼠气管直视；B 气管插管一次成功率；C 术前死亡率；与7 d相比*P<0.01。图1 小鼠手术前准备训练

注：与1week相比*P<0.05。图2 结扎冠状动脉左前降支准确率

注：A:模型建立时间变化；B:模型稳定性变化；与1 month相比*P<0.05；#与5 m相比P<0.05。图3 小鼠急性心肌梗死模型建立熟练程度及稳定性变化趋势

3 讨 论

笔者曾赴美国天普大学、宾夕法尼亚大学心脏领域著名实验室交流学习。最大的感受就是美国实验室的专业化：一项研究，被划分为若干个小的研究，由擅长的实验室专职人员协助展开实施，相互之间紧密配合，保证了研究的顺利实施，也保证了结果的可靠性。以某个药物在心脏功能方面的研究为例，转基因鼠的制备与繁育、动物模型的制备、心脏超声测定与分析和压力-容积导管的测定及分析等重要环节均有擅长的实验室专职人员进行操作或者指导操作，保证最终得到的结果真实可靠。

反观国内，与这些著名的实验室还具有一定差距。国内实验室，所配备专职人员，多进行研究设计或者从事大型仪器操作为主。研究多需要博士生或者硕士生全程进行操作及分析。在研究生阶段，需要进行文化课学习、研究实施、文章准备及毕业论文准备等过程，真正可以用于研究的时间有限，对于较为复杂及需要训练很多的技能，难以做到熟练掌握。

为了解决这个困境，笔者的解决办法是挑选1～2名实验室技术人员，悉心指导，使其熟练掌握并精通其中一项耗时耗力的技能，建立一个可靠的技术平台。充分利用实验室技术人员稳定的特点，将一些关键的实验技术规范化，既保证给研究生提供有力的技术支持又保证了实验数据的真实、可靠及可重复性。

医学研究生的导师和辅导老师，大多具有繁重的医疗任务和教学任务，限于有限的精力，往往只能给出课题计划、思路等较为宏观的指导，在细节方面则很难抽出足够的精力，给予指导。相反，实验室技术人员与研究生的相处时间很多，可以从科研思维、理论知识及动手能力等方面给予其较大影响[6]。

实验室技术人员大多具有硕士及以上学位或者长期从事科研的经历，经过长期的科研训练，具有良好的发现问题、分析问题和解决问题的能力，在科研思维、课题规划、理论知识储备、实际操作等方面对研究生产生重要影响，增强其创新能力，保障研究顺利进展。实验室技术人员分工明确，积极推动各项规章制度的制定和执行，营造一个良好的科研氛围，无疑会对研究生的科研活动产生积极的结果[2, 6-9]。科研工作需要严谨的设计，更需要良好的实践才能得到可靠的结果。研究生经过本科阶段的学习和研究生阶段的学习，对本专业相关知识掌握良好，而动手能力却是不可避免的短板。研究生在开始课题研究之后，需要经过大量训练并认真总结经验教训后，才能掌握良好的实验技能，顺利开展课题研究。

研究生在理论学习阶段，实践机会有限，所学实验技能不能满足课题研究需要。实验室技术人员在实验室长期工作于科研一线，对实验设备性能及使用具有深入了解，对实验操作熟悉，积累了丰富的实践经验。研究生在科研过程中，具体实验遇到问题，实验室技术人员可以从试剂、仪器、操作步骤、注意事项和操作技巧等角度给予指导，传授自己的“独家”经验，保证其得到真实可靠的数据和结果，提高研究生的实验技能，推动研究的进展。

[1]陈洪菊, 屈艺, 母得志. 实验室技术人员在研究生培养中的作用 [J].实验室研究与探索, 2011. 30(8):189-191.

[2]陈华萍, 寇毅, 王关嵩, 等. 医院实验室建设在研究生培养中的作用 [J].西部医学, 2011, 23(8): 1617-1618.

[3]Gao E, Lei YH, Shang X,etal. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse [J]. Circ Res, 2010, 107(12): 1445-1453.

[4]Yi W, Sun Y, Yuan Y,etal. C1q/tumor necrosis factor-related protein-3, a newly identified adipokine, is a novel antiapoptotic, proangiogenic, and cardioprotective molecule in the ischemic mouse heart [J]. Circulation, 2012, 125(25): 3159-3169.

[5]Sun Y,Yi W, Yuan Y, et al. C1q/tumor necrosis factor-related protein-9, a novel adipocyte-derived cytokine, attenuates adverse remodeling in the ischemic mouse heart via protein kinase A activation[J]. Circulation, 2013. 128(11 Suppl 1): S113-120.

[6]米青荣. 浅谈高校实验室工作人员素质 [J].邯郸农业高等专科学校学报, 2002, 19(3): 33-34.

[7]刘鸣昊, 张丽慧. 浅谈医学实验室的研究生教学管理 [J].中国中医药现代远程教育, 2015, 13(24):163-165.

[8]赵青山. 加强实验室管理,提高研究生科研创新能力 [J].实验科学与技术, 2015, 13(5): 146-148.

[9]刘金成, 杨剑, 魏旭峰, 等. 实验室管理在医学研究生培养中的作用 [J].现代生物医学进展, 2015. 15(4): 731-733.

Thelearningcurveofestablishinganacutemyocardialinfarctioninmiceandthetrainingoflaboratorytechnicians

Zhao Bi-jun, Tan Yan-zhen, Yang Jian, Jin Zhen-xiao, Xiong Hong-yan, Yu Shi-Qiang

DepartmentofCardiothoracicSurgery,Xi'anCentralHospital,Xi'an710003,China

XiongHong-yan,Email:xionghy000@163.com

ObjectiveTo analyze the learning curve of establishing an acute myocardial infarction (AMI) in mice, with an eye on the importance of laboratory technicians in the training of medical postgraduates.MethodsFour volunteers with no operation basis were involved to establish AMI models of mice which were evaluated from the preoperative mortality, accuracy, the required time and stability.ResultsAfter at least 1 months of training, the preoperative mortality of mice was reduced to a reasonable range (less than 5%); after at least six months of training, operations can be done in (20±2) min.ConclusionLaboratory technicians play an important role in the training of medical postgraduates, especially in some of demanding platform techniques.

Laboratory; Technician; Mouse model; Acute myocardial infarction

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.04.10

国家自然科学基金面上项目(81570231，81570230，81570232)

710032 西安，空军军医大学第一附属医院心血管外科(赵璧君，谭延振，杨 剑，金振晓，熊红燕，俞世强)；710003 西安，西安市中心医院心胸外科(熊红燕)

熊红燕，E-mail：xionghy000@163.com

2017-07-04)

2017-08-17)