南洋楹组培快繁技术优化研究

晏 姝 ，胡德活 ，韦如萍 ，王润辉 ，郑会全 ，曾建雄

（1.广东省森林培育与保护利用重点实验室，广东 广州 510520；2.广东省林业科学研究院，广东 广州510520；3.博罗县林业科学研究所，广东 惠州 516100）

南洋楹组培快繁技术优化研究

晏 姝1，2，胡德活1，2，韦如萍1，2，王润辉1，2，郑会全1，2，曾建雄3

（1.广东省森林培育与保护利用重点实验室，广东 广州 510520；2.广东省林业科学研究院，广东 广州510520；3.博罗县林业科学研究所，广东 惠州 516100）

以南洋楹优树种子无菌苗单株作为初始外植体，通过均匀设计和正交设计试验筛选培养基配方，并对诱导增殖流程、培养条件、炼苗等技术环节进行了优化研究，建立南洋楹无性系规模化组培快繁技术。结果表明：南洋楹外植体在诱导培养基MS + 6BA 0.5 mg/L诱导分化2周期后，转入增殖培养基MS +6BA 0.2 mg/L +NAA 0.02 mg/L+蔗糖30 g/L，采用自然光源培养4周期，可显著抑制玻璃化现象，增殖倍数达4.1；生根培养基为1/2MS+NAA 0.01 mg/L +IBA 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L，生根率72.3%；将生根与炼苗过程结合进行可增强植株抗性，移栽成活率提高至92.5%。

南洋楹；组培技术；优化

南洋楹Paraserianthes falcataria ( L.) Nielsen是含羞草科Mimosaceae 南洋楹属Paraserianthes常绿乔木，种植后3～4年可成林、5～8年可利用[1]，其根系具有结瘤固氮能力，可改良土壤、提高地力，是世界著名的生态友好型速生用材树种[2]。我国系统开展南洋楹研究始于上世纪90年代，由广东省林业科学研究院组织省内有关高校和科研院所联合开展技术攻关，在南洋楹种质资源收集保存、优良品系选择、栽培技术研究等方面取得了丰硕成果[3-5]，但南洋楹组培快繁技术尚处于初步试验阶段[6-8]，主要由于外植体采集困难、灭菌难度高、玻璃化及黄化现象严重、炼苗移苗技术薄弱等瓶颈问题而未取得实质性进展。本研究对诱导增殖流程、培养基以及培养条件、炼苗等技术环节进行了优化，为南洋楹无性系规模化繁殖提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

采集广东省博罗县林业科学研究所南洋楹优树BLS16种子，通过无菌苗培育苗技术*(本技术已申请专利：201510683550.2)建立南洋楹组培苗无菌体系，选取一株生长健壮的无菌苗作为初始外植体。

1.2 方 法

1.2.1 诱导培养

切除外植体根部后，切分为2段，其中一段含1个顶芽和一个腋芽，另一段含2个腋芽（含子叶），接入诱导培养基培养50 d后，切除基部老化愈伤组织并分割，再培养40 d。诱导培养基的成分为：MS + 6BA 0.5 mg/L，附加蔗糖30 g/L、卡拉胶7 g/L、pH值5.8（下同）。观察植株分化情况。

1.2.2 增殖培养

将愈伤组织和丛芽转入预备试验获得的较适宜增殖培养基（MS + 6BA 0.1 mg/L），长度大于3.0cm的芽体单独切下，并分段切割，每段至少含2个芽。连续培养8个周期，每个周期35 d，获得无性系瓶苗试验材料。增殖培养基优化试验采用均匀设计建立试验方案（表1），每个处理试验瓶苗数为25瓶，35 d后统计各处理增殖倍数、平均苗高，并观察植株生长状况。

表1 3因素6水平试验方案Table 1 Test project of 3 factors with 6 levels

表1 3因素6水平试验方案Table 1 Test project of 3 factors with 6 levels

1.2.3 生根与炼苗

不定芽增长到3～5 cm时，切下转入生根培养基。生根培养基优化试验采用正交设计建立试验方案（表2），每个处理试验瓶苗数为20瓶。培养室内暗培养10 d后，移到室外遮阴蓬中闭瓶炼苗7 d，统计各处理生根率，并将生根率进行反正弦转换后进行正交试验结果方差分析。瓶苗生根后，揭去瓶盖注入清水（保持水量为培养基平面以上1～2 cm），开盖炼苗3 d后可移栽。

表2 正交设计试验方案Table 2 Test project of orthogonal design

表2 正交设计试验方案Table 2 Test project of orthogonal design

1.2.4 培养条件

培养室温度为(25±2)℃，光照强度1 500～3 000 lx，光照时间每天12 h。增殖培养的前4个周期培养光源采用自然光（可接受除11点到15点的直射阳光）。

1.2.5 苗木移栽

用浓度为5%的多菌灵洗净瓶苗根部的培养基后，于晴天下午4点半后移栽至育苗基质中，育苗基质为体积比为3∶1的黄心土和泥碳土，覆盖透明塑料薄膜，每天早晚用喷雾器喷水，保持湿度85%，晴天时需覆盖遮阴网。30 d后除去塑料薄膜。

2 结果与分析

2.1 外植体诱导与分化

外植体接入诱导培养基10 d后，基部出现膨大并逐步伴有淡黄色愈伤组织产生；继续培养14 d后，子叶基部、腋芽和顶芽可见绿色芽原基突起，随后迅速萌生小芽；培养至50 d后，基部愈伤组织老化、颜色变为黑褐色，丛芽伸长速度变缓，大部分分化出的小芽被愈伤组织包围。分割转接培养40 d，可继续诱导丛芽的分化，但有效芽诱导率明显降低，当芽生长到2～3 cm时停止伸长，并随着时间的推移，逐渐变粗、透明、多水。试验结果表明，南洋楹外植体的诱导对激素反应十分敏感，长时间、高激素环境打破了植物内外源激素的平衡，使体内激素受体趋于饱和状态[9]，导致丛芽玻璃化、叶片卷曲变脆，严重影响后期的伸长生长。

2.2 增殖培养及其培养基优化

将愈伤组织和丛芽转入预备试验获得的低激素增殖培养基（MS + 6BA 0.1 mg/L），培养光源采用自然光（可接受除11点到15点的直射阳光）培养4个周期后，植株玻璃化现象明显改善，恢复正常生长。经8个周期增殖培养后，平均增殖倍数2，共获得生长良好的无性系瓶苗200瓶。增殖培养基优化试验结果（表3）表明，随着6-BA浓度从0.1～0.5 mg/L递增，增殖倍数呈先增大后降低的趋势，而苗径组织成熟度降低、苗色变黄；NAA的浓度与增殖倍数无明显相关规律，2种激素浓度对苗高生长的影响也不明显；低激素和高碳源浓度组合的苗径组织成熟度较高、含水量少，极少出现玻璃化现象。可见，适宜浓度的6-BA是促进南洋楹增殖倍数提高的主导因素，其中试验3：6-BA 0.2 mg/L +NAA 0.02 mg/L+蔗糖30 g/L增殖倍数可达到4.1、平均苗高3.2 cm，且苗木生长健壮、苗色正常、愈伤组织幼化，有利于进一步生根培养或继续增殖培养。

表3 增殖培养基优化试验结果Table 3 The results of proliferation medium optimization test

2.3 生根培养基筛选

选择苗高3～5 cm、叶色正常、茎干健壮的植株进行生根培养基筛选试验。转入生根培养基培养10～20 d 后, 观察不同生根培养基中植株的生根效果。4个试验因素包括MS、NAA、IBA、蔗糖，各3个浓度水平对生根率的影响方差分析（表4）结果表明，NAA浓度对生根率的影响在0.01水平上差异极限著，MS浓度在0.1水平差异显著，而IBA和蔗糖对生根率的影响不显著。

表4 不同因素对生根率的影响方差分析Table 4 Variance analysis of the effects of different factors on rooting rate

从表5可知，在不同配方生根培养基中，植株生根及生长表现各不相同。在低NAA浓度条件下，根系多数从韧皮部生出，且根系柔软、不宜折断；随着激素浓度的提高，根部愈伤组织增多，根系从愈伤组织生出，且根系粗、脆，在移栽时容易脱落；在低MS浓度条件下，植株易变黄、掉叶，可能与南洋楹生长速度快、对营养元素需求较大有关；正常生长的植株，无论是韧皮部生根或愈伤组织生根，生根时间约为15d左右。生根试验结果表明，试验1：1/2MS+NAA 0.01 mg/L +IBA 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L诱导生根效果最好，生根率可达72.3%。

表5 生根培养基筛选试验结果Table 5 The results ofrooting medium screening test

2.4 强化炼苗生根法移栽效果分析

将传统生根加炼苗方法和强化炼苗生根法移栽成活率统计数据进行了对比（表6），结果表明，传统方法生根加炼苗需要24 d，平均根长4.7 cm，移栽成活率为55.0%；强化炼苗法将生根与炼苗过程结合进行，培育时间缩短至16 d，平均根长2.3 cm，移栽成活率提高至92.5%，且植株健壮、苗色深绿，移栽效果显著提高。

表6 移栽效果分析Table 6 Transplanting effect analysis

3 结论与讨论

3.1 激素的影响效应

6-BA是多数木本植物体诱导和增殖培养的主导激素[10-12]，对南洋楹芽的诱导启动也是必需的，在不加任何激素的MS 基本培养基中，南洋楹外植体既不能增殖，也不能伸长，长时间保持初始状态；在浓度为0.5 mg/L 6BA的诱导下，迅速分化增殖。但随着时间的推移，有效芽诱导率明显降低，芽体变粗、透明、多水，可见，6BA的过度积累打破了南洋楹体内生长素和细胞分裂素平衡水平,从而抑制了芽的生长。因此，选择合适的激素配比对保证较高的增殖倍数和较好芽体的长势极为重要[13]。本研究采用了均匀设计试验法优化增殖培养基激素浓度及配比，以6个代表性的试验组合反映体系的主要特征，结果表明6BA和NAA的浓度要在较低水平且两者之间的比例要在较高水平上才能获得理想的增殖率和长势。

IBA和NAA是植物组织培养中广泛应用于诱导生根的生长素[14]，多数学者认为[9，15-16]，IBA 对促进生根有很好的效应，它在被植物吸收后不易在体内运输，往往停留在所施部位诱导根原体的形成、促进维管束系统的分化，生出的根系细而疏。但经南洋楹生根培养基正交试验发现，NAA对生根率的影响极限著（P＜0.01），而不同IBA浓度对生根影响较小，且低NAA浓度（0.01 mg/L）与IBA配合使用，根系多数从韧皮部生出，柔软、不易折断，植株更粗壮、更浓绿，本结论与胡新颖[6]研究认为低浓度的NAA 有利于南洋楹的生根结论一致。

3.2 玻璃化和黄化现象的抑制

玻璃化是植物组织培养中所特有的现象，玻璃苗绝大多数来自茎尖或茎切段培养物的不定芽[17]。由于南洋楹采用芽分化增殖结合芽伸长增加腋芽数量的方法进行增殖，因此极易产生玻璃化现象，采用降低激素浓度、降低培养基中的NH4+浓度、增加培养基硬度和提高碳源浓度等方法均难以取得理想改善效果。但我们将已发生或将发生玻璃化现象的植株放置于自然光（可接受除11点到15点的直射阳光）培养4个周期后，发现植株成熟度、幼茎木质化程度和叶绿素合成速度均迅速提高，可见，自然光源对南洋楹玻璃化现象有显著的改善作用，并且在后续增殖周期中采用人工光源培养也极少产生玻璃化现象。南洋楹玻璃化现象发生及其改善的机理性研究有待进一步深入探索。

南洋楹在组培增殖和生根过程中均易出现黄化、掉叶现象，可能与南洋楹愈伤组织分生旺盛、生长迅速，而其茎枝组织疏松、贮藏的醣类物质少有关。本试验研究发现，低激素和高碳源浓度增殖培养基所培养的苗径组织成熟度较高、叶片浓绿，Vengadesan等[18]认为蔗糖除了能为植物提供碳源，同时也起着调节培养基渗透压的作用，蔗糖浓度过低，则不能满足细胞营养、生长、代谢的需要；马钟丽[19]和吕亚凤[20]在厚荚相思的快繁研究中同样发现蔗糖浓度对增殖倍数的影响不大，但高蔗糖浓度苗长势好、粗壮,玻璃化率也低。在低MS浓度生根培养基所培养的南洋楹植株虽能正常生根，但逐渐变黄、掉叶，其原因可能是低MS浓度培养基的营养物质不足以完全支持植株的生长[21]。因此，适合的蔗糖和MS浓度有利于南洋楹黄化现象的改善。

3.3 强化炼苗生根

按照传统的组培流程，经过一定生根培养周期后再进行3～7 d炼苗，所培养的南洋楹植株通常根长超过5 cm、苗茎纤细、掉叶、萎蔫，可能由于植株长期处于高湿、弱光、异养条件下形成的枝叶组织分化不完善，在自然环境中容易失水而萎蔫脱落[22]。根据南洋楹速生、强阳性生理特征，将生根与炼苗过程结合进行，在控制根长、缩短培育周期的同时，强化植株对外界环境的适应性培养，提高光合自养能力和组织分化成熟度，经过强化炼苗生根后的植株强壮、根长适宜、抗性增强，移栽成活率显著提高。

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Optimization of tissue culture technology of Paraserianthes falcataria ( L.)nielsen

YAN Shu1,2, HU Dehuo1,2, WEI Ruping1,2, WANG Runhui1,2, ZHENG Huiquan1,2, ZENG Jianxiong3
(1.GuangdongProvincial Key Laboratory of Silviculture, Protection and Utilization, Guangzhou 510520, Guangdong, China;2. Guangdong Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China;3. Boluo Forestry Research Institute, Huizhou 516100, Guangdong, China)

Sterile seedling developing from the plus tree seed was cultured as the initiation explant to establish the large-scale tissue culture of Paraserianthes falcataria, by taking uniform design and orthogonal design to selectculture mediums and optimizing inducingmultiplication,condition of culture and seedling hardening, etc. The result showed that the explant should be cultured 2 cycles in induction medium MS + 6BA 0.5 mg/L, and then transferred into proliferation medium MS +6BA 0.2 mg/L +NAA 0.02 mg/L+sucrose 30 g/L with natural light cultured 4 cycles, which could signi fi cantly inhibit the vitri fi cation and the proliferation rate up to 4.1; the optimum rooting medium was 1/2MS+NAA 0.01 mg/L +IBA 0.2 mg/L+ sucrose 20 g/L, the rooting rate was 72.3%, the survival rate could improve to 92.5% by rooting combining with seedling hardening.

Paraserianthes falcataria; tissue culture; optimization

S723.1+32.6

A

1673-923X(2017)06-0065-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.06.011

2016-08-09

广东省省级科技计划项目“南洋楹组培与无性系选育研究”（2013B020305003）、广东省林业科技创新项目“南洋楹无性系选育研究与示范”（2014KJCX011、2016003）

晏 姝，硕士，高级工程师

胡德活，研究员；E-mail：hudehuo@163.com

晏 姝，胡德活，韦如萍，等. 南洋楹组培快繁技术优化研究[J].中南林业科技大学学报，2017, 37(6): 65-69.

[本文编校：吴 彬]