蚬壳花椒种子总RNA提取方法比较与优化

荣 健 ，周 韬 ，王 平 ，孙吉康 ，彭 昕

（中南林业科技大学 a.生命科学与技术学院；b.环境科学与工程学院，湖南 长沙 410004）

蚬壳花椒种子总RNA提取方法比较与优化

荣 健a，周 韬a，王 平b，孙吉康a，彭 昕a

（中南林业科技大学 a.生命科学与技术学院；b.环境科学与工程学院，湖南 长沙 410004）

蚬壳花椒种子中富含油脂、多糖和多酚类等成分复杂的次生代谢物质，影响其总RNA的提取，一般的提取方法无法获得总RNA或者总RNA降解严重。本实验采用改良CTAB法、TRNzol法、试剂盒法、传统CTAB法提取总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳，核酸蛋白检测仪检测以及RT-PCR验证等对提取结果进行比较与分析。结果表明：TRNzol法、试剂盒法、传统CTAB法未能从蚬壳花椒种子中提取到总RNA，改良CTAB法能提取完整性较好、纯度较高的RNA，28S及18S条带清晰整齐，D260/D280值为2.07，提取的总RNA适用于RT-PCR实验，可以为后续的分子生物学研究奠定了基础。

蚬壳花椒；总RNA提取；改良CTAB法；RT-PCR

蚬壳花椒Zanthoxylum dissitium Hemsl，又名单面针、山批把、大叶花椒、蚌壳花椒等[1]，属芸香科花椒属攀援藤本植物[2]。根、茎及叶均含有白藓碱等有效成分，具有祛风活络、散瘀止痛、解毒消肿的功效[3-4]。同时蚬壳花椒果皮多糖具有显著的抗肿瘤活性，增强机体免疫功能[5]，在抗肿瘤药物研发方面具有很高的经济价值。蚬壳花椒生长于较高的土壤pH条件，喜阳喜湿润气候[6]，主要分布在湖南、广西、广东、贵州、甘肃、湖北等地区[7]。在蚬壳花椒研究前期，马英姿[8-10]、费明亮等主要是对蚬壳花椒生理生化以及化学成分的研究与分析。在自然条件下，蚬壳花椒种子具有深度生理性胚休眠，难以萌发可能是导致蚬壳花椒自然繁殖率低下的重要障碍[11]。研究发现，已去除种皮的蚬壳花椒种子在GA处理6 h后培养，种子中油脂的含量显著降低。蚬壳花椒种子中油脂含量的降低是否与油脂代谢途径中关键性基因的表达相关，目前尚未见报道。因此，为了获得相关基因，并阐明其在GA处理下的表达特征，获取高质量的蚬壳花椒种子RNA是进行RTPCR[12-13]、Northern印记杂交、构建cDNA文库等分子生物学研究的基础[14]。这在很大程度上制约了相关研究的深入开展。目前，提取RNA的方法有多种，包括Trizol试剂盒、苯酚法[15]、异硫氰酸胍法[16-17]及SDS-酚抽提法[18]等，但是没有一种方法能够适用于不同种植物或者同种植物不同组织的RNA提取。专门针对蚬壳花椒种子总RNA提取的有效方法报道尚未见到。由于蚬壳花椒种子中含有大量脂肪、多糖、蛋白质等化合物，在RNA提取过程中脂肪等次生代谢物质去除不干净，会导致污染。在沉淀RNA时，由于多糖的许多理化性质与RNA很相似，往往会产生富含多糖的凝胶状沉淀，这种多糖的RNA沉淀难溶于水，或者溶解后产生粘稠状的溶液，在去除多糖的同时RNA也容易被带走，造成RNA产量的减少，同时多糖或其他杂质的存在，还会影响许多酶的活性[19]。因此，本试验在参考其他植物组织RNA提取方法的基础上，选取了4种不同的RNA提取方法，包括TRNzol法、快速RNA提取试剂盒、传统CTAB法和改良CTAB法。通过比较四种不同的提取蚬壳花椒种子总RNA方法，找到最佳的提取RNA方法，为深入开展蚬壳花椒分子生物学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

1.1.1 材 料

蚬壳花椒采集于湖南省张家界市青坪乡，采回的的蚬壳花椒新鲜种子置于-20℃冰箱中保存备用。

1.1.2 仪 器

1）自动蒸汽灭菌锅：致微（厦门）仪器有限公司 GI36TW；

2）电热恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；

3）超净工作台：天津市泰斯特仪器有限公司CJ-2D；

4）液氮生物容器：乐山市东亚机电工贸有限公司 YPS-10；

5）掌上离心机：杭州奥盛仪器有限公司Mini-6K；

6）高速冷冻离心机：Eppendorf 5424R；

7）微量移液器：Eppendorf；

8）PCR仪：Bio-Rad CT006487；

9）凝胶成像系统：杭州汇尔仪器设备有限公司 JS-680B；11）核酸蛋白分析仪：Eppendorf BioPhotometer Plus；

10）电泳仪、电泳槽：北京君意东方电泳设备有限公司 JY600、JY-SPCT。

1.1.3 试 剂

1）TRNzol总RNA提取试剂：购自天根生化科技有限公司。

2）CTAB提取缓冲液、DEPC处理水、酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）、无水乙醇：购自湖南长沙康网生物科技有限公司 。

3）植物总RNA提取试剂盒：购自天根生化科技有限公司。

4）DNase I：购自大连宝生物有限公司。

1.2 试验方法

试验中使用的溶液经过0.1% DEPC配置后再高压灭菌使用，玻璃器皿、研钵、镊子等用锡箔纸包裹，180℃干热灭菌3 h以上；塑料制品经过121℃高压灭菌20 min，烘箱中烘干后备用，使用RNase-Free 的枪头和离心管；用体积分数75%的乙醇擦拭移液枪，防止带入RNAse，影响试验结果；电泳槽、梳子用0.5 mol/L NaOH浸泡1 h以上，双蒸水淋洗干净。

1.2.1 TRNzol法

将蚬壳花椒在液氮中研磨成粉末后，取50～100 mg样品于离心管中，参考TRNzol法进行，获得的RNA在离心管中室温放置晾干，加入30～100 mL RNase-Free ddH2O，反复吹打，混匀，充分溶解RNA，-80℃保存。

1.2.2 植物RNA提取试剂盒

按照天根生化科技有限公司的RNA Pure Plant Kit植物RNA快速提取试剂盒说明书进行。

1.2.3 传统CTAB法

1)取小量组织于研砵中液氮充分碾磨至粉末，转移到1.5 mL离心管中加入1 mL CTAB，立即充分混匀。2)将混匀的组织在65℃，水浴20 min。3)加入等体积氯仿：异戊醇（24∶1）充分混匀。4)4 ℃，12 000 rpm离心10 min。5)取上层水相，加入等体积的酚仿（酚∶氯仿 25∶24）充分混匀，4℃，12 000 rpm 离心10 min。6)取上层水相，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）充分混匀。4℃，12 000 rpm 离心10 min。7)取上层水相，加入等体积异丙醇-20℃沉淀1 h以上，4℃，12 000 rpm 离心10 min。8)弃上清，加1 mL 75%乙醇，洗涤沉淀，重复一次，洗涤用4℃，12 000 rpm 离心5 min，弃上清。9)离心15 s，用枪吸干乙醇，真空干燥2～4 min。10)加20～50 mL ddH2O，室温溶解10 min，-80℃保存。

1.2.4 改良CTAB法

RNA提取参照传统CTAB法并加以改良，具体步骤如下：1)～7)同传统CTAB法。8)弃上清，加1 mL75%乙醇，洗涤沉淀。9）缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12 000 rpm离心15 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。10）向吸附柱CR3中加入350 mL去蛋白液RW1，12 000 rpm离心15 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。11）DNase I工作液的配制：取10 mL DNase I储存液放入新的RNase-Free 离心管中，加入70 mL RDD溶液，轻柔混匀。12）向吸附柱CR3中央加入80 mL的DNase I工作液，室温放置15 min。13）向吸附柱CR3中加入350 mL去蛋白液RW1，12 000 rpm离心15 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。14）向吸附柱CR3中加入500 mL漂洗液RW，12 000 rpm离心15 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。15）重复步骤9。16）12 000 rpm离心2 min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free 离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30～50 mL RNAse-Free ddH2O，室温放置2 min，12 000 rpm离心1 min，得到RNA溶液。

1.2.5 RNA纯度及浓度检测

取2 mLRNA样品在1.2%琼脂糖凝胶0.5*TBE电泳，120 V电压下电泳25 min，凝胶成像系统检测总RNA的完整性。取1uL RNA样品用RNase-Free ddH2O 稀释50倍，混匀，用Eppendorf核酸蛋白质检测仪测定A260/A280、A260/A230以及RNA浓度。

1.2.6 RT-PCR分析

按TaKaRa PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 进行反转录。根据NCBI上已知的ACTin基因序列，利用primer 5.0设计引物。Fw-GTGCTGGATTCTGGTGATGG；Rv-ATTTCCCGTTCGGCTGTG。反应体系为20 mL：94℃预变性 3 min；55.5℃ 30 s，72℃ 45 s，进行33循环；72℃延伸7 min，4终止反应。取5 mL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照记录。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取的蚬壳花椒种子总RNA完整性分析

图1显示的是不同提取方法对蚬壳花椒种子提取的总RNA质量的影响，从图中可以看出，（泳道1-2）TRNzol方法没有去处多糖的干扰，在加入异丙醇沉淀RNA时得到一大团非透明白色沉淀，虽然加RNAse-Free ddH2O溶解RNA时沉淀也随之降解，从电泳结果看泳道中RNA条带不清晰，加样孔处有明显亮带，说明该方法提取得到的RNA中有蛋白质和DNA污染。（泳道3-4）单独利用植物试剂盒法提取的总RNA可以看出28S、18S 2条带荧光亮度相近且较弱，表明该方法并不能有效的从蚬壳花椒种子的油脂和蛋白质中分离出RNA，从而造成总RNA质量低于正常浓度且完整性差。（泳道5-6）采用传统CTAB法提取总RNA，28S和18S条带清晰明亮，同时点样孔下方有明显亮带，说明在无DNase I酶作用下传统CTAB法并不能有效去除DNA污染。（泳道7-8）改良CTAB法提取总RNA，28S和18S条带清晰明亮，2条带荧光亮度接近2∶1，条带之间无弥散现象，在28S条带上方无其他明显条带存在，表明无DNA和蛋白质等污染，该方法相对TRNzol法，植物试剂盒法，传统CTAB法有效提高了总RNA质量和完整性。

图1 蚬壳花椒种子RNA凝胶电泳图Fig.1 Electrophoresis of Zanthoxylum dissitium Hemsl total RNA extraction with different extraction methods

2.2 不同方法提取的蚬壳花椒种子总RNA质量浓度和纯度的检测

吸光值在280、320、230、260 nm下分别代表了核酸、溶液浑浊度、盐浓度和蛋白等有机物的含量[20]。RNA的A260/A280介于1.8～2.1之间，可以认为RNA纯度较好，且A260/A230应大于2.0。从表1可以看出传统CTAB法和TRNzol法A260/A280值均小于1.8分别为1.67和1.55说明采用传统CTAB和TRNzol法RNA样品中均有不同程度的蛋白质、多糖或DNA污染，但TRNzol法的A260/A230远小于2.0，表明裂解液中有异硫氰酸胍或β-巯基乙醇的残留。植物试剂盒法和改良CTAB法的A260/A280值均在1.8～2.0之间分别为1.82和2.07，说明植物试剂盒法和改良CTAB法提取的RNA样品无多糖、蛋白质等杂质，也没有DNA污染。从表1可以看出改良CTAB法提取RNA产量为140 mg/g远高于其他三种方法提取的RNA产量。

表1 不同方法提取的RNA的纯度及得率的比较Table 1 Effect of total RNA extracted by four different methods

2.3 RT-PCR验证提取的RNA

为进一步验证传统CTAB法改良CTAB法提取的RNA质量，分别取4 mlRNA进行反转录得到cDNA后用内参基因ACT的引物进行PCR验证。从图2可以看出改良后的CTAB法PCR结果所得目的条带清晰完整、无非特异性条带可以用于后续分子实验，而传统CTAB法PCR结果伴有明亮的非特异性条带，说明在RNA提取产物中含有DNA污染，造成PCR结果伴有非特异性条带。

图2 蚬壳花椒种子RNA的RT-PCR反应产物Fig.2 Result of total RNA production of Zanthoxylum dissitium Hemsl

3 讨论与结论

纯度高、完整性好的RNA是进行分子克隆实验以及基因表达的分析基础[21]。目前已有多种不同动植物的RNA提取报道[22-23]，采用柱式植物总RNA试剂盒法和TRNzol法提取动植物总RNA是目前普遍快速简便的方法，它们共同的优点在于操作简单、耗时较少，一般在1～2 h内即可完成。由于植物组织含有多糖、多酚等次生代谢产物，这些物质在细胞裂解后可与RNA紧密结合形成难溶复合物或胶冻状沉淀[14]，很难将其取出，TRNzol是可即用的从细胞和组织中提取总RNA的试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRNzol可保持RNA完整性，同时裂解细胞，溶解细胞内含物。柱式植物总RNA提取试剂盒在蚬壳花椒种子RNA提取过程中能够得到产量较低的RNA，且由于试剂盒比较昂贵，因此，在需要大量的RNA进行后续的分子生物学实验时，此方法不适用。虽然这两种方法已在多种植物中得到有效的验证，但蚬壳花椒种子内油脂含量较多，在其细胞裂解后会形成大量油脂，因而TRNzol法无法分离样品中的油脂部分使得样品中带有较多的杂质。柱式植物总RNA提取法虽然能有效去除杂质部分，但RNA提取量相对偏低，这可能是由于吸附柱无法将蚬壳花椒种子样品中溶于油脂内的RNA分离的原因所造成的RNA产量过低。

蚬壳花椒种子含有大量的次生代谢化合物，在RNA的提取过程中如果去除不干净，往往会造成污染，使RNA的得率低，纯度差等问题，影响实验的进一步开展。在提取蚬壳花椒种子RNA过程中主要有以下两方面问题：1）油脂含量高，使样品的研磨和后续的RNA提取变难[24]；2）次级代谢产物如多糖等含量高且复杂，影响RNA得率和纯度。为了解决这些问题，在借鉴前人的基础上，改进了CTAB的提取过程，主要有如下五点：1）在研磨蚬壳花椒种子时，研磨要充分且快速，防止研磨不及时易成块，同时加入少量裂解液进行研磨，有利于种子成分的溶解；2）在CTAB的提取液中加入β–巯基乙醇，作为强还原剂，可以防止多酚物质的氧化，在后续抽提过程中有效的沉淀出酚；3）通过氯仿去除油脂，增加氯仿抽提的次数，解决了操作过程中过柱易堵塞滤膜、吸取上清液时易受上层漂浮油层干扰的问题，使提取的 RNA纯度更高，而且过柱过程操作更加方便，4）增加去蛋白次数，由于蚬壳花椒种子蛋白质较多，加入氯仿很难去净，所以用去蛋白液RW1两次，充分去除蛋白； 5）DNAse I酶的使用，去除了实验过程中造成的DNA污染。

本文针对蚬壳花椒种子，分别用TRNzol法、试剂盒法和传统CTAB法、改良CTAB法进行RNA提取方法的比较。改良的CTAB方法能有效地从蚬壳花椒种子中提取纯度高、完整性高的总RNA。经过核酸蛋白测定仪测定A260/A280比值为2.07，电泳28S、18S条带清晰，比值约为2，该法解决了提取RNA过程中油脂无法分离、多糖等杂质和DNA污染等问题。用蚬壳花椒ACT基因的RT-PCR结果表明，改进的CTAB法提取的总RNA可直接用于后续的分子生物学实验。

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Comparison and analysis of total RNA extracting methods from Zanthoxylum dissitium Hemsl

RONG Jiana, ZHOU Taoa, WANG Pingb, SUN Ji-kanga, Peng Xina
(a. College of Life Science and Technology; b. College of Environmental Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Seeds of Zanthoxylum dissitium Hemsl are rich in secondary metabolites with complex composition, such as polysaccharide and phenol, which seriously harden the isolation of its total RNA. As a consequence, general extraction method would make the total RNA seriously degrade, or could not obtain total RNA at all. Therefore, this paper through four methods including modi fi ed CTAB method, Trizol method, Plant RNA Kit and traditional CTAB method, were used to extract the total RNA with the extraction results being compared and analyzed by agarose gel electrophoresis, BioPhotometer plus and RT-PCR veri fi cation. The result showed that Trizol method, Plant RNA Kit and traditional CTAB method failed to extract the Total RNA from Zanthoxylum dissitium Hemsl seeds, whereas the modi fi ed CTAB method successfully extracted the total RNA with relatively good integrity and high purity. The 28S rRNA and 18S rRNA bands of the extracted RNA were clear and tidy, with the ratio of OD260/OD280being 2.07, which makes the extracted total RNA very suitable for RT-PCR experiments. The isolation of high quality RNA from Zanthoxylum dissitium Hemsl seeds by modi fi ed CTAB method indicated that polysaccharide and phenol compounds could be effectively eliminated through this approach, and could satisfy the requirement of following molecular biology study.

Zanthoxylum dissitium Hemsl; RNA extraction; modi fi ed CTAB method; RT-PCR

S789

A

1673-923X(2017)06-0060-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.06.010

2016-07-04

国家自然科学基金项目“蚬壳花椒种子萌发过程中基因与蛋白质的表达差异研究”（31370612）

荣 健，硕士研究生

王 平，教授，博导；E-mail：wangping@csuft.edu.cn

荣 健，周 韬，王 平，等. 蚬壳花椒种子总RNA提取方法比较与优化[J].中南林业科技大学学报，2017,37(6):60-64.

[本文编校：吴 彬]