溶出型抗菌纺织品的体外细胞毒性评价

周晓芳

摘要

目的：探究溶出型抗菌纺织品的体外细胞毒性。方法：用MTT比色法检测溶出型抗菌纺织品浸提液浓度对小鼠成纤维细胞L929细胞相对增殖率的影响，并评价其细胞毒性。结论：细胞存活率随着溶出型抗菌织物浸提液浓度的提高有所下降，但均高于空白对照组的70%，不认为被测试样有潜在细胞毒性。

关键词：抗菌；纺织品；溶出型；细胞毒性；MTT比色法

1 引言

据国内外学者研究，人体皮肤表层存在三类菌群：（1）常驻菌群（是保护人体免受有害微生物侵袭的屏障）；（2）过路菌群（往往是致病菌或条件致病菌）；（3）共生菌群（对常驻菌群有支持作用，对过路菌群有拮抗作用）。这三类菌群与皮肤共同构成一个动态平衡的微生态系统，一旦平衡被打破，即可能导致皮肤感染或其他疾病[1]。抗菌纺织品具有抗菌卫生自洁功能，一般为内衣、鞋袜等直接接触皮肤的纺织品，所以对其生物安全性提出很高要求，需在抗菌的同时又不会对人体造成伤害[2]。行业标准FZ/T 73023—2012中规定了用晕圈法评价抗菌纺织品所用抗菌剂的溶出安全性。一方面可对抗菌剂的溶出性进行判断，另一方面为抗菌纺织品的安全性提供判定依据。其中规定：按照标准程序洗涤一次后测试，若抑菌圈宽度D>1mm，可判定为溶出型抗菌织物；经洗涤一次后，用晕圈法测试溶出性，要求D<5mm。非溶出型抗菌劑与纤维上的羟基、氨基起反应后与纤维结合，稳定性强、缓释速度均匀，故只触及织物纤维被污染的微生物，绝少接触到皮肤黏膜，具有较高的耐久性与安全性。溶出型的抗菌剂则用交联树脂固着在纤维上，抗菌物质缓释但不均匀，此类产品抗菌效果虽好，但会影响到皮肤层的菌群，所以无论从安全性还是从织物抗菌作用的耐久性考虑，这类抗菌剂不是最佳选择[1]。本文将主要探究溶出型抗菌纺织品的体外细胞毒性。

2 试验原理、试剂和材料

MTT细胞毒性检测（参照国家标准GB/T 16886.5—2003《医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》进行）。

原理：该检测方法是建立在通过细胞的代谢活性衡量细胞活性的基础上，黄色水溶性MTT[3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5，二苯基溴化四氮唑噻唑蓝]在活细胞内会转化为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒。在甲瓒溶解于乙醇后，通过分光光度计可以测出颜色强度的变化从而推算出活细胞数。

试验材料：细胞系，小鼠成纤维结缔组织细胞（L929细胞），由中国科学院细胞库提供。

设备和试剂：培养箱、超净工作台、水浴锅、倒置相差显微镜、酒精灯、离心机、电子天平、96孔板分光光度计（配备570nm滤光片，参照650nm）、微板振荡器、细胞计数器或血球计数器、移液器、8道移液器（批量稀释用）、组织培养瓶、96孔组织培养微孔板、注射过滤器。化学试剂、培养基、MEM培养基（不含酚红指示剂）、谷氨酰胺和碳酸氢钠、胎牛血清（FCS）、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS）、MTT[3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5，二苯基溴化四氮唑噻唑蓝]、异丙醇（分析纯）。

3 试验部分

3.1 试验准备工作

培养基：准备DMEM （含碳酸氢钠缓冲体系）用于日常培养。10% 胎牛血清、4mM/L 谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素完全培养基置于4℃保存，且保存时间不超过两周。

MTT溶液：将MTT溶解于无添加物、无酚红的MEM培养基，浓度为1mg/mL。配好的溶液用注射过滤器过滤除菌（孔径≤0.22?m）。MTT溶液应在配制当天使用。

样品及其浸提准备工作：准备10份日常检测中收集的来自不同公司生产的溶出型抗菌织物，厚度均小于0.5mm。样品按ISO 10993-12：2012进行浸提。试样大小：6cm×10cm；阴性对照：2g高密度聚乙烯；萃取液：10mL不含血清的DMEM培养基。振荡24h浸提所有溶液，玻璃器皿等应消毒处理，且所有操作应在超净工作台中的无菌条件和环境下进行。

3.2 试验方法

第1天：细胞复苏后，要经过2～3次传代才能用于检测。通过酶消化法（胰蛋白酶）将细胞培养物从培养瓶中转移出来，离心细胞悬液（200g、3min），然后将细胞重悬且将细胞浓度调整到1×105 cells/mL。用多道排枪吸取100?L培养基加到96孔培养板的外围孔（空白孔）。在剩余的孔中，加入100?L浓度为1×105cells/mL或1×104cells/mL细胞悬液，培养24h（5%CO2、37℃、湿度>90 %）至细胞形成半汇合单细胞层。这个培养期确保细胞恢复且趋向对数生长期，为了避免试验误差，在相差显微镜下观察细胞培养板中细胞生长状况。

第2天：培养24h之后，将孔中的培养基吸去。向每孔加入100?L含适当浓度（100%、50%）样品浸提液的处理培养基，加入100?L阴性对照（高密度聚乙烯0.2g/mL浸提）、阳性对照（含10% DMSO的MEM培养基）、空白对照（含10%血清MEM培养基），各试样均做5个平行孔。培养细胞24h（5%CO2、37℃、湿度>90 %）。

第3天：处理24h之后，在倒置相差显微镜下检查确认接种细胞是否存在系统误差，并观察各试验组和对照组细胞的生长特点。记录下细胞由于检测样品浸提液的细胞毒性而产生的细胞形态学的变化。对照组细胞异常生长则说明试验有错误，试验需重做。在检测完培养板后，小心弃去板中的培养基，因为浸提液中的还原剂同样会降低MTT，从而导致假阴性结果。然后向各孔中加入50?L的MTT溶液，培养2h（5%CO2、37℃、湿度>90%）之后弃去MTT溶液，每孔加入100?L异丙醇，轻轻晃动培养板约30min，随后将板放入装配了570nm滤光片的酶标仪中读取吸光度（参考波长650nm）。

3.3 试验数据分析

计算细胞相对增殖率（RGR），RGR=试验组吸光度平均值/空白对照组吸光度平均值×100%。将试验组RGR转化为0～4级材料毒性评级（CTS）。当RGR≥100%、80%～99%、50%～79%、30%～49%、0～29%时，分别对应细胞毒性等级0、1、2、3、4级。如果细胞存活率低于空白对照组的70%，那么被测样品有潜在细胞毒性。

加入MTT检测前，倒置显微镜下观察细胞生长情况，可见阳性对照组细胞数明显降低，细胞胞体圆缩，大量坏死、崩解；空白对照组细胞轮廓清晰，呈梭形或多角状，胞质透明、较大，细胞数明显增加；试验组细胞形态无明显异常，可见少量的细胞碎片和胞体圆缩（图1）。

细胞毒性测定结果见表1。统计学分析表明，各试验组、空白对照组的OD值与阳性对照组之间均有统计学差异（P<0.05）；而各试验组的OD值与空白对照组之间均无统计学差异（P>0.05）。试验组细胞毒性级别均为1级。

4 总结

MTT比色法是一种能快速检测细胞增殖、细胞毒性的比色分析法，已被广泛应用于免疫学、肿瘤学、药物毒理学和医用材料的生物相容性评价。本试验结果显示：细胞存活率随着溶出型抗菌织物浸提液浓度的提高有所下降，但均高于空白对照组的70%，试验组细胞毒性评级均为1级，不认为被测10份试样有潜在细胞毒性。纺织品抗菌性能及安全性能的测试方法与实际穿着或其他应用尚有相当的距离，本试验仅对10份溶出型抗菌纺织品进行了相关评价和分析，具有一定的局限性。如果想要全面了解溶出型抗菌纺织品的安全性能，还需对该类抗菌纺织品进行大量的试验和考察，有待进一步研究。

参考文献：

[1]张复全， 郭金福. Cleancool?纤维的抗菌性能检测及安全性评述[J].针织工业，2010（10）：27-31.

[2]张娟， 田新阶， 龚?. RTCA技术对抗菌剂APP的体外细胞毒性评价[A]. 2014年（首届）抗菌科学与技术论坛论文摘要集[C]. 2014：122-125.

（作者单位：广州市纤维产品检测研究院）endprint