外泌体内microRNA—135a跨血脑屏障转运的初步研究

刘辰庚++郝婷+杨婷婷++孟双+王培昌

[摘要] 目的 初步研究外泌体内microRNA-135a（miR-135a）跨血腦屏障和细胞转运的现象。 方法 提取APP/PS1双转基因小鼠脑脊液（CSF）的高miR-135a外泌体，将其注射入野生型小鼠脑室并干预SH-SY5Y细胞，检测小鼠外周血和培养基外泌体内miR-135a水平及SH-SY5Y细胞β分泌酶-1（BACE-1）的表达和活性。 结果 高miR-135a外泌体脑室注射能使野生型小鼠CSF和血浆外泌体miR-135a显著升高（P < 0.05）；经APP/PS1双转基因小鼠CSF源外泌体干预的SH-SY5Y细胞，其细胞内的miR-135a含量显著高于其他干预组和对照组（P < 0.05）；SH-SY5Y细胞的BACE-1活性显著降低（P < 0.05），且其mRNA表达水平的变化趋势与活性变化趋势一致。 结论 外泌体可将脑脊液中的“高miR-135a”这一生物信号跨越血脑屏障传递至外周血，这为将血浆外泌体miR-135a作为阿尔茨海默病诊断生物标志物提供了更坚实的实验依据。

[关键词] 阿尔茨海默病；MicroRNA；外泌体

[中图分类号] R749 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（c）-0022-05

A preliminary study on the cross blood-brain-barrier transport of exosomal microRNA-135a

LIU Chengeng1 HAO Ting2 YANG Tingting1 MENG Shuang3 WANG Peichang1

1.Department of Clinical Laboratory， Xuanwu Hospital， Capital Medcial University， Beijing 100053， China； 2.Department of Pathology， Heze Municipal Hospital， Shandong Province， Heze 274000， China； 3.State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control， National Institute for Communicable Disease Control and Prevention， Chinese Center for Disease Control and Prevention， Beijing 102206， China

[Abstract] Objective To study the effect of microRNA-135a （miR-135a） on blood-brain barrier and cell transport in exocrine. Methods The high miR-135a exosomes were extracted from the cerebrospinal fluid （CSF） of the transgenic mice and injected into the ventricles of the wild type mice and intervened with SH-SY5Y cells. The levels of miR-135a in the peripheral blood of mice and the exosomes of the culture， and the expression and activity of β-secretase-1 （BACE-1） in SH-SY5Y cells were determined. Results Intraventricular injection of miR-135a exosomes resulted in a significant increase in CSF and plasma exosomal miR-135a in wild-type mice （P < 0.05）. The activity of BACE-1 in SH-SY5Y cells treated with exosomes harvest from the CSF of APP/PS1 double transgenic mice was significantly lower than that in other intervention group and control group （P < 0.05）， and the mRNA expression level of SH-SY5Y cells was significantly lower than that of control （P < 0.05）. The trend of change is consistent with the trend of activity. Conclusion The signal of "high miR-135a" can be transferred from CSF to blood through the blood-brain barrier， which provides a more solid experimental basis for the use of exosomal miR-135a as a biomarker of Alzheimer's disease.

[Key words] Alzheimer′s disease； MicroRNA； Exosome

微小核糖核酸（microRNA，miR）在发育、分化和衰老等方面都扮演了重要角色[1]。作为重要的神经退行性变疾病之一，阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）的发生发展也不乏相关miR的参与[1-2]。本课题组的前期研究表明，miR-135a可抑制重要的AD相关蛋白——β分泌酶-1（β-site APP cleaving enzyme，BACE-1）的蛋白表达并降低其在细胞内的活性，且这种作用是通过其与BACE-1 mRNA的3′非翻译区（3′-UTR）直接结合而实现的[1，3]。APP/PS1双转基因小鼠具有较典型的AD样病理学和行为学改变，是应用较多的AD模型。本课题组研究表明，APP/PS1双转基因小鼠和AD患者的脑脊液（cerebro spinal fluid，CSF）中总体miR-135a水平显著升高，且小鼠和AD患者CSF和血清中泌体（exosome）内miR-135a亦升高，提示其可作为AD的潜在生物标志物[3]。但外周血中的核酸来源复杂，主要包括组织细胞的病理/生理释放以及细胞死亡/凋亡释放等来源[4-6]，在前期研究中被检测到升高的外泌体内miR-135a是否主要来自脑脊液，抑或脑脊液中的高miR-135a状态是否能直接导致外周血中相应指标的改变并未明确[1，3]。本研究主要就脑脊液外泌体内miR-135a跨血脑屏障向外周血转运的现象进行初步研究。endprint

1 材料与方法

1.1 試剂与仪器

外泌体提取试剂盒、Trizol、Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国加利福尼亚）；DMEM培养基（Gibco，美国加利福尼亚）；PBS、小牛血清、蛋白浓度测定试剂盒、引物合成（生物工程公司，中国上海）；miR-135a拟似物、Ce_miR-39（Tiangen，中国北京）；QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、RNA逆转录试剂盒（Qiagen，德国威斯特法伦）；BACE-1活性测定试剂盒（Sigma，美国威斯康星）；立体定位仪（Stoelting，美国伊利诺斯）；罗氏480 PCR仪（Roche，瑞士巴塞尔）；D-8紫外可见分光光度计（菲勒公司，中国江苏）。

1.2 外泌体提取

9月龄APP/PS1双转基因小鼠[SPF级饲养，合格证号：SYXK（京）2014-0036]和9月龄野生型小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所，使用立体定位仪抽取CSF；使用眼球摘除法留取肝素抗凝血，于4℃下3000 r/min离心7 min，留取血浆。在无菌环境下，使用外泌体提取试剂盒分别提取CSF，提取出的外泌体经PBS重悬混匀后，再次提取，以去除其他影响因素，再次提取出的外泌体混合物经miR-135a浓度测定后使用PBS重悬成105 copy/mL备用。使用立体定位仪将提取自转基因小鼠CSF的外泌体（105 copy/mL miR-135a）注射入野生型小鼠的第三脑室（定位为前囟前2.0 mm，中缝旁2.0 mm，硬膜下4 mm）作为实验组（5只），使用等体积的PBS注射作为对照组（5只）。6 h和12 h后抽取CSF和血浆标本，提取外泌体[7]。本实验方案已经首都医科大学宣武医院伦理委员会批准。

1.3 细胞培养

SH-SY5Y细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基中，分别使用来自转基因小鼠和野生型小鼠CSF和血浆的外泌体干预（miR-135a终浓度为105 copy/L），同时使用miR-135a拟似物及Lipofectamine 2000包裹的miR-135a拟似物作用上述细胞作为对照组，干预6 h和12 h后提取细胞总RNA，同时提取培养基的外泌体。根据干预物的名称进行分组，实验组和对照组实验均重复5次。

1.4 BACE-1活性测定

使用试剂盒检测BACE-1的活性，严格按照试剂盒说明书操作：使用PBS将提取并经离心的细胞总蛋白调整至5～7 g/L，加入检测液，使用标准曲线法检测BACE-1的相对活性（相对荧光值）[1]。

1.5 BACE-1 mRNA定量测定

使用Trizol试剂提取SH-SY5Y细胞总RNA。使用QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，以GAPDH为内参，分别使用qPCR检测外泌体干预组和各个对照组BACE-1的mRNA。BACE-1上游引物：3′-AGGCAGTCTCTGGTATACACCCATC-5′，下游引物：3′-T？鄄GCCACTGTCCACAATGCTC-5′，产物长度137 bp；GAP？鄄DH上游引物：3′- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-5′，下游引物：3′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-5′，产物长度138 bp；反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 30 s，35个循环。使用2-ΔΔCt法进行相对定量[5]。

1.6 小RNA提取及miR-135a定量测定

20 μL逆转录体系中含RNA模板0.4 ng，20 μL miR检测体系中含miR cDNA 1.0 μL。反应条件：95 ℃3 min；95℃ 25 s，62℃ 35 s，72℃ 25 s，35个循环。以提取小RNA前向标本中加入的Ce_miR-39为内参，使用2-△△Ct法计算并统计miR-135a组间表达的差异。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物标本外泌体内miR-135a检测结果

提取自9月龄APP/PS1双转基因小鼠CSF外泌体内的miR-135a水平显著高于提取自野生型小鼠CSF和血浆外泌体水平（P = 0.000）。提取自9月龄APP/PS1双转基因小鼠血浆外泌体内的miR-135a水平显著高于提取自野生型小鼠CSF和血浆外泌体水平（P = 0.000）。见表1。

2.2 外泌体干预动物实验结果

经高miR-135a外泌体注射的野生型小鼠，其6 h的CSF和血浆外泌体内miR-135a水平均显著高于对照组（P < 0.05）；12 h后，实验组CSF和血浆外泌体内miR-135a水平与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

与同时间对照组CSF比较，*P < 0.05；与同时间对照组血浆比较，#P < 0.05；CSF：脑脊液

2.3 外泌体干预细胞实验结果

干预6 h后，使用APP/PS1双转基因小鼠CSF源外泌体干预的SH-SY5Y细胞，其细胞内miR-135a含量显著高于其他干预组和对照组（P < 0.05）；干预12 h后，细胞内miR-135a水平恢复到基线水平（图2）。干预6 h和12 h后，使用APP/PS1双转基因小鼠CSF源外泌体干预的SH-SY5Y细胞，其培养基外泌体内miR-135a水平与其他来源外泌体干预组及miR-135a拟似物组间差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。endprint

與同时间转基因小鼠CSF源外泌体干预比较，*P < 0.05；与同时间转基因小鼠血浆源外泌体干预比较，#P < 0.05；CSF：脑脊液

图2 外泌体干预细胞实验结果（n = 5）

2.4 BACE-1活性和表达

干预6 h后，经提取自9月龄APP/PS1双转基因小鼠CSF外泌体和Lipofectamine 2000包裹miR-135a拟似物干预的SH-SY5Y细胞的BACE-1活性显著低于经提取自转基因小鼠血浆及提取自野生型小鼠CSF和血浆外泌体干预的SH-SY5Y细胞（P < 0.05），且前两者差异无统计学意义（P > 0.05）（图3）。SH-SY5Y细胞BACE-1 mRNA表达水平的变化趋势与其活性的变化趋势一致（图4）。

与同时间转基因小鼠CSF源外泌体干预比较，*P < 0.05；与同时间转基因小鼠血浆源外泌体干预比较，#P < 0.05；CSF：脑脊液

3 讨论

作为发病率最高的神经退行性变疾病，AD在全世界范围内的检出率均呈上升趋势。2011年以前，在AD各版诊断标准中涉及的诊断方法主要为行为、精神量表评分和较为昂贵的影像学检查；2011年3月，发布的AD诊断标准中，首次纳入了CSF tau蛋白和β淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）检测[8-9]。但CSF tau蛋白和Aβ检测面临的现实问题是，作为已经出现典型痴呆症状AD患者而言，目前尚无有效的治疗手段，患者和家属往往不配合CSF抽取；而对于AD的早期诊断和筛查而言，受试者也很难同意采用抽取CSF这种有创检查的方式进行诊断[10-13]。故CSF tau蛋白和Aβ检测在国内开展并不多见。随着AD生物标志物研究的不断进展，越来越多的学者认为应寻找可用于AD诊断，特别是早期诊断的无创检查生物标志物[14]。目前，小分子核酸和特定蛋白在AD诊断中价值的研究逐渐成为热点。

脑组织中的淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）可通过α和β两种分泌酶代谢，通过β分泌酶（BACE-1）代谢时，将产生可导致AD的Aβ[15]。有研究表明，AD患者脑组织中的BACE-1表达和活性均显著升高，提示其可能参与了AD的发生发展[16]。本课题组的前期研究发现，miR-135a可通过与BACE-1 mRNA的3′-UTR相结合从而抑制其表达和酶活性；同时，CSF和血清外泌体中miR-135a水平显著升高，提示miR-135a的升高可能是AD患者脑细胞自我保护的机制之一[17]。

血脑屏障并不允许核酸分子自由通过，为何血清与脑脊液中会出现miR-135a同方向的变化趋势，该问题尚待解答。已有研究预测，外泌体可作为细胞间信息传导及旁分泌的载体[7，18]。本研究通过将提取自AD模型小鼠脑脊液中的高miR-135a外泌体转入正常小鼠脑室，以此观察高miR-135a外泌体的出现对脑组织BACE-1表达和酶活性的影响，及外泌体是否能将“高miR-135a”这一生物学信号跨越血脑屏障传达至外周血。结果表明，注射入脑室的高miR-135a外泌体可使野生型小鼠脑脊液和血浆内外泌体内miR-135a均升高，提示外泌体能跨越血脑屏障，且能将高miR-135a这一生物信息传达至外周血；同时，也能将这一信号传入脑细胞内并发挥miR-135a的生物学作用。

有研究提示，外泌体的信号转导能将某些病理生理状态在细胞间传递[19-20]。本研究的细胞实验结果表明，使用APP/PS1双转基因小鼠CSF源外泌体干预的SH-SY5Y细胞，其培养基外泌体内miR-135a水平与其他干预组和对照组间无显著性差异，提示高miR-135a不能改变传代脑细胞系向外界分泌外泌体内的miR-135a水平。如将高miR-135a外泌体的分泌看做细胞发出的保护信号，那么接收到这些信号的细胞可能并未将其进行再传递。

综上所述，本研究表明，外泌体可将脑脊液中的“高miR-135a”这一生物信号跨越血脑屏障传递至外周血，这为将血浆外泌体miR-135a作为AD诊断生物标志物提供了更可靠的实验依据。

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（收稿日期：2017-08-10 本文編辑：程 铭）endprint