益肾祛浊方对PCOS—IR大鼠Ghrelin、SHBG及VF的影响

张晓丹+++蔡云+++许昕

[摘要] 目的 探討益肾祛浊方对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗（PCOS-IR）模型大鼠胃动素相关肽（Ghrelin）、性激素结合球蛋白（SHBG）及血清内脂素（VF）水平的影响。 方法 将84只6周龄SD雌性大鼠完全随机化分组分为7组，每组各12只，具体如下：空白组、模型组、益肾祛浊方高剂量组、益肾祛浊方中剂量组、益肾祛浊方低剂量组、益肾组及二甲双胍组。造模成功后，灌服不同剂量益肾祛浊方或益肾方（益肾祛浊方高剂量组6460 mg/kg，益肾祛浊方中剂量组3230 mg/kg，益肾祛浊方低剂量组1615 mg/kg，益肾组1400 mg/kg，空白组灌服生理盐水），以二甲双胍作对照，观察用药后各组大鼠Ghrelin、SHBG及VF水平的变化。 结果 模型组Ghrelin水平较空白组显著降低（P < 0.05），益肾祛浊方各剂量组及益肾组Ghrelin水平较模型组升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。模型组SHBG水平较空白组降低（P < 0.05），各治疗组SHBG水平较模型组升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。模型组VF水平较空白组升高（P < 0.05），各治疗组VF水平较模型组降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。模型组睾酮（T）、黄体生成素/卵泡刺激素（LH/FSH）比值与空腹胰岛素（FINS）较空白组显著升高（P < 0.05），益肾祛浊方各剂量组T及LH/FSH比值较模型组降低，益肾组T水平较模型组降低，益肾祛浊方各剂量组及二甲双胍组FINS较模型组降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 益肾祛浊方能通过改善PCOS-IR模型大鼠的胰岛素抵抗相关因子，抑制雄激素合成增加，恢复机体糖、脂代谢平衡，遏制PCOS-IR的恶性循环，达到治疗PCOS-IR的目的。

[关键词] 多囊卵巢综合征胰岛素抵抗；益肾祛浊方；胃动素相关肽；性激素结合球蛋白；内脂素

[中图分类号] R711.75 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（c）-0009-05

Effects of Yishen Quzhuo Decoction on the expression of Ghrelin， SHBG and VF in rats with PCOS-IR

ZHANG Xiaodan1 CAI Yun2 XU Xin1

1.Department of Gynecology， Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100010， China； 2.Department of Gynecology， Beijing Tongzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Beijing 100142， China

[Abstract] Objective To observe the effects of Yishen Quzhuo Decoction on the expression of Ghrelin， sex hormone-binding globulin （SHBG） and visfatin （VF） in rats with polycystic ovarian syndrome-insulin resistance （PCOS-IR）. Methods Eighty-four female SD rats aged 6-week old were completely randomized into 7 groups， with 12 rats in each group， the groups were as followed： blank group， model group， high dose of Yishen Quzhuo Decoction group， middle dose of Yishen Quzhuo Decoction group， low dose of Yishen Quzhuo Decoction group， Yishen group and Metformin group. After the model was established successfully， different doses of Yishen Quzhuo Decoction or Yishen Decoction were given by gavage （high dose of Yishen Quzhuo Decoction group： 6460 mg/kg； middle dose of Yishen Quzhuo Decoction group： 3230 mg/kg； low dose of Yishen Quzhuo Decoction group： 1615 mg/kg； Yishen group： 1400 mg/kg； blank group： normal saline）， Metformin was taken as control， the level changes of Ghrelin， SHBG and VF in rats of each group after medication were observed. Results The level of Ghrelin in the model group was significantly lower than that of blank group （P < 0.05）， while the levels of Ghrelin in each dose of Yishen Quzhuo Decoction group and Yishen group were significantly higher than that of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The level of SHBG in the model group was significantly lower than that of blank group （P < 0.05）， while the levels of SHBG in each treatment group were significantly higher than that of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The level of VF in the model group was significantly higher than that of blank group （P < 0.05）， while the levels of VF in each treatment group were significantly lower than that of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The levels of testosterone （T）， luteinizing hormone/follicle stimulating hormone （LH/FSH）， fasting insulin （FINS） were significantly higher than those of blank group （P < 0.05）， the levels of T， LH/FSH in each dose of Yishen Quzhuo Decoction group were lower than those of model group， the level of T in Yishen group was lower than that of model group， the levels of FINS in each dose of Yishen Quzhuo Decoction group and Metformin group were lower than that of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Yishen Quzhuo Decoction can improve the factors related to insulin resistance of rats with PCOS-IR， inhibit the increase of androgen synthesis， restore the balance of glycometabolism and lipid metabolism， contain the vicious circle of PCOS-IR， so as to achieve the purpose of treating PCOS-IR.endprint

[Key words] Polycystic ovarian syndrome-insulin resistance； Yishen Quzhuo Decoction； Ghrelin； Sex hormone-binding globulin； Visfatin

多囊卵巢综合征（PCOS）是青春期及育龄期女性常见的内分泌和代谢紊乱性疾病，以稀发排卵或持续无排卵、高雄激素和/或高胰岛素血症、卵巢多囊样变为主要特征，常见月经失调或闭经、不孕、多毛、肥胖、胰岛素抵抗（IR）等[1]。IR是指各種原因使胰岛素促进组织细胞对葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症以维持代谢状态所需血糖水平，是机体靶细胞对正常水平胰岛素反应低下的一种病理改变[2]，特点为空腹血糖值正常而空腹胰岛素（FINS）水平升高。1980年，Berger等[3]发现PCOS肥胖妇女血清胰岛素与睾酮、雄烯二酮有明显相关性，推测高胰岛素血症与PCOS发病有关。调查发现，PCOS患者IR发生率为50%～70%[4]。多项研究显示，胃动素相关肽（Ghrelin）、性激素结合球蛋白（SHBG）、血清内脂素（VF）与PCOS-IR密切相关。本研究基于“冲脉隶于阳明”“肾主生殖”等中医经典理论，在前期研究[5]及动物实验[6]基础上，进一步验证益肾祛浊方（国家专利申请号20170368825.2）对PCOS-IR模型大鼠Ghrelin、SHBG、VF等IR相关因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

取84只6周龄SD雌性大鼠，体重约150 g，将其完全随机化分为七组，每组12只，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物合格证书编号：11401300038666；在北京市中医研究所屏蔽动物房饲养，许可证编号：SCXX（京）2009-0017。

1.2 实验用药

盐酸二甲双胍肠溶片（北京利龄恒泰药业有限公司，批号H11021560）；羟甲纤维素钠（安徽山河药用辅料股份有限公司，批号160301）；来曲唑（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号HI9991001）。

益肾祛浊方由续断、桑寄生、败酱草等12味中药组成。制备成中药水煎剂，按成人用量折算成大鼠用量（每天正常人给药剂量/成人体重×6.25，默认成人体重60 kg），设为中剂量（3230 mg/kg）。中剂量浓度为低剂量浓度的2倍（6460 mg/kg），高剂量浓度为中剂量浓度的2倍（1615 mg/kg）。益肾方由续断、桑寄生等6味中药组成，制备成中剂量以作对照（1400 mg/kg）。

1.3 实验试剂

Ghrelin酶联免疫试剂盒（Phoenix Pharmaceuticals，货号PK-031-31）、SHBG酶联免疫试剂盒（CLOUD-CLONE CORP，货号SEA396Ra）、VF酶联免疫试剂盒（CLOUD-CLONE CORP，货号SEA638Ra），卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、睾酮（T）、FINS放射免疫试剂盒，由北京北方生物技术研究所有限公司提供。

1.4 造模方法

参考蔡云等[7]的来曲唑联合高脂饲料造模法，建立PCOS-IR大鼠模型。该实验结果显示：来曲唑联合高脂饲料喂养大鼠30 d，大鼠体重显著增加，血清T、LH/FSH比值、FINS等均异常升高，空腹血糖值正常，大鼠卵巢可见多囊样改变，所有数据符合PCOS-IR典型病理特征，证实造模成功。

1.5 治疗方法

七组大鼠分组情况如下：空白组、模型组、益肾祛浊方高剂量组、益肾祛浊方中剂量组、益肾祛浊方低剂量组、益肾组、二甲双胍组。造模成功后，各治疗组大鼠给予相应剂量药物灌胃，空白组及模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃，连续灌服15 d。其间空白组大鼠予普通饲料喂养，其余各组大鼠予高脂饲料喂养。

1.6 观察指标

各组大鼠于灌胃结束后禁食水24 h后，以2%戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉，取大鼠腹主动脉血，离心并收集血清。Ghrelin、SHBG、VF等均用酶联免疫吸附法测定，严格按试剂盒说明书操作。

1.7 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析。各指标经正态检验及方差齐性检验，符合正态分布及具备方差齐性，采用Tukey法作组间多重比较，方差不齐时用Dunnett T3法作组间多重比较。衡量变量间密切程度用Pearson相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

所有实验大鼠灌胃后，各项生命体征正常，试验周期内无大鼠死亡。

2.2 益肾祛浊方对PCOS-IR大鼠Ghrelin、SHBG及VF的影响

模型组Ghrelin、SHBG水平较空白组降低，VF水平较空白组升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。益肾祛浊方各剂量组及益肾组Ghrelin水平较模型组升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；益肾祛浊方高剂量组Ghrelin水平较二甲双胍组明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。各治疗组SHBG水平较模型组升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；各治疗组VF水平较模型组降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；益肾祛浊方中剂量组及益肾组VF水平较二甲双胍组显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.3 益肾祛浊方对PCOS-IR大鼠T、LH/FSH、FINS的影响

模型组T、LH/FSH及FINS水平较空白组明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。益肾祛浊方各剂量组及益肾组T水平明显低于模型组；益肾祛浊方各剂量组LH/FSH比值明显低于模型组；益肾祛浊方高剂量组、益肾祛浊方中剂量组及二甲双胍组FINS水平明显低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。二甲双胍组各激素指标与模型组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。endprint

2.4 Ghrelin、SHBG、VF与T、LH/FSH及FINS的相关性

2.4.1 空白组及益肾祛浊方各剂量组Ghrelin与T水平显著相关；模型组、二甲双胍组、益肾组Ghrelin与T水平无显著相关性。各组SHBG与T水平显著相关。各组VF与T水平无显著相关性。见表3。

2.4.3 空白组、益肾祛浊方各剂量组及益肾组Ghrelin与FINS水平显著相关。各组SHBG与FINS水平无显著相关性。空白组、益肾祛浊方各剂量组及二甲双胍组VF与FINS水平顯著相关，益肾组VF与FINS水平无显著相关性。见表5。

3 讨论

自1980年Berger首次提出IR参与PCOS发病，研究证实IR是PCOS发病的中心环节和致病基础[9]。西医治疗PCOS-IR首选二甲双胍，该药通过促进肠道对葡萄糖的吸收，抑制糖原分解，减少肝糖原异生，提高外周组织对葡萄糖的敏感性[10]。二甲双胍治疗PCOS-IR，可降低胰岛素水平，纠正高雄激素血症，改善排卵功能，但远期效果不够理想，且伴有胃肠道不良反应[11]。中医药治疗PCOS，可显著降低睾酮水平，恢复月经周期，提高患者排卵功能，疗效优于达英-35，且不良反应少[12]。本研究提示，益肾祛浊方对PCOS-IR模型大鼠具有良好的治疗作用，疗效优于二甲双胍。

Ghrelin是一种具有强促生长激素释放功能的活性多肽，在中枢、卵巢及胃肠道发挥多种调控作用[13-14]。研究证明，PCOS患者经治疗后，血FINS水平明显下降，而Ghrelin水平显著升高[15]，由此可知FINS与Ghrelin之间存在负相关关系。SHBG能特异性结合并转运性激素，调控性激素浓度，影响其生物利用度[16]。血中性激素水平可影响SHBG在肝脏的合成过程[17]，LH异常升高可刺激卵泡膜细胞产生过多雄激素，高浓度睾酮抑制肝脏合成SHBG；SHBG缺乏会导致游离睾酮增多，进而转化为过多雌酮，E1>E2反馈性刺激LH分泌增多，诱发高胰岛素血症，形成恶性循环。VF是一种脂肪细胞因子，具有类胰岛素的降糖活性[18-20]，参与组织局部炎性反应等。VF可促使脂肪细胞分化和存储以调节脂代谢，通过类胰岛素样作用调节糖代谢[21]。现有研究认为，PCOS与全身低度反应炎症有关，是一种慢性炎症过程[22]，而PCOS-IR是PCOS发展到代谢紊乱的严重阶段，VF水平升高，也是PCOS-IR的重要病机之一。

根据PCOS-IR的特征及证候，中医妇科学将其归属于“闭经”“不孕”“崩漏”等范畴。本病以肾虚、脾虚痰湿、阳明浊热蓄积等病机为主，涉及三焦、胃肠、肾等多个脏腑；本研究治法为补肾健脾，祛浊调经。前期实验结果证实益肾祛浊方能够改善PCOS-IR大鼠高雄激素血症，纠正LH/FSH比值异常等内分泌紊乱状态，降低FINS水平，改善卵巢多囊样变，综合疗效较二甲双胍更具优势[6]。本研究结果提示，益肾祛浊方能使低水平Ghrelin升高，提高SHBG浓度，纠正高雄激素状态，改善内分泌紊乱，恢复生殖轴功能；同时降低异常升高的FINS与VF水平，改善脂代谢及体内慢性炎症状态，遏制PCOS-IR高雄激素及高胰岛素血症糖脂代谢紊乱的恶性循环，达到治愈疾病的目的。通过分析各因子间相关性可证实，PCOS-IR破坏了机体内分泌与脂代谢平衡，益肾祛浊方可使性激素及IR相关因子恢复平衡状态，且效果优于益肾方。鉴于Ghrelin与T和FINS的双重显著相关性，考虑其是兼能观察内分泌和脂代谢紊乱与否的敏感指标。

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（收稿日期：2017-08-04 本文编辑：张瑜杰）endprint