乳酸菌发酵对红茶饮料营养成分、香气成分及抗氧化活性的影响

刘佳奇，彭 珍，熊 涛*

乳酸菌发酵对红茶饮料营养成分、香气成分及抗氧化活性的影响

刘佳奇，彭 珍，熊 涛*

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，食品学院，江西 南昌 330047）

以植物乳杆菌菌剂发酵红茶饮料为研究对象，分别采用酒石酸铁比色法、茚三酮比色法和标准碱滴定法测定红茶发酵前后的茶多酚、茶氨酸、咖啡碱及乳酸含量；采用4 种不同体外抗氧化模型来考察红茶饮料发酵前后的抗氧化活性；并采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术分析红茶发酵前后主要香气成分。结果表明，发酵后红茶饮料茶多酚和咖啡碱含量比发酵前稍有下降，茶氨酸含量较发酵前显著上升（P＜0.05）；对部分自由基的清除能力较发酵前略有下降；醇类和酮类等香气成分在发酵后较发酵前有明显增加，有利于提升红茶的香气品质。

乳酸菌；发酵；红茶饮料；抗氧化性；风味物质

乳酸菌不仅能改善食品风味，有利于食品保藏[1-2]，而且对食品中的维生素、有机酸、氨基酸等营养成分与种类都有提升作用[3-4]。乳酸菌发酵食品的开发已成为食品工业的研究热点之一，越来越多的乳酸菌发酵饮料走进了消费者的视线，其营养保健功能和独特风味也深受消费者青睐。近两年来，乳酸菌发酵饮料为饮料行业一个新趋势，比如乳酸菌果蔬汁、乳酸菌奶茶、乳酸菌植物饮料等。市场上乳酸菌发酵茶饮料种类较少，相关文献也不多。有专利报道[5]，将乳酸菌或酵母菌接种至加糖的茶水中进行发酵，可制得风味独特的茶饮料。胡燕等[6]在茶浸提液中加入糖、乳粉等原料进行乳酸菌发酵，对工艺参数进行了优化。江洁等[7]选用乳酸菌和酵母菌发酵红茶，并加入淀粉糖浆，开发出了发酵红茶饮料。刘佳奇等[8]通过乳酸菌发酵铁观音，开发的茶饮料风味独特，口感醇和。相关研究较多集中在工艺研究，而针对单一乳酸菌发酵对茶饮料的成分及功能性研究鲜为少见。

本实验选用植物乳杆菌菌剂制得发酵红茶饮料，分析红茶发酵前后活性成分及体外抗氧化活力的变化，同时对发酵前后香气成分进行初步探讨，为乳酸菌发酵红茶饮料的工艺优化及功能性研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌菌剂（NCU177）由南昌大学食品科学与技术国家重点实验室提供；红茶（正山小种）购买于江西省南昌市茶叶市场，产于福建武夷山，质量级别三级；果葡糖浆、白砂糖均为食品级。

无水乙醇、硫酸亚铁、过氧化氢、氯化亚铁、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁（均为分析纯） 天津市大茂化学试剂厂；邻二氮菲、抗坏血酸标准品、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、咖啡因标准品、茶氨酸标准品 美国Sigma公司；Fe3＋还原能力（ferric reducingantioxidant power，FRAP）检测试剂盒、2,2’-联氨-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐自由基（2,2’-azinobis(3-ehtylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt radical，ABTS＋·）清除能力检测试剂盒 碧云天生物技术研究所。

1.2 仪器与设备

FE20型数显pH测定仪 梅特勒-托利多国际股份有限公司；DNP-9272生化培养箱 上海精宏试验设备有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设厂；LXJ-ⅡB型低速台式离心机上海安亭科学仪器厂；YP5001分析天平 上海良平仪器仪表有限公司；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；Varioskan LUX多功能微孔板读数仪 赛默飞世尔科技有限公司；7890/7000A三重四极杆气相色谱-串联质谱联用仪 安捷伦科技有限公司；手动固相微萃取进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS57328-U萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵红茶工艺流程

茶叶→浸提→过滤→茶汁→调配→灭菌→冷却→发酵→红茶半成品

浸提：料液比1∶100（g/mL）、浸提温度95 ℃、浸提时间10 min；过滤：300 目尼龙纱布滤去茶渣得滤液；调配：滤液中加入果葡糖浆；灭菌：温度105℃，时间20min；发酵：通过单因素以及正交试验确定最佳工艺。

发酵前样品：浸提灭菌后冷却至室温，待测；发酵后样品：按最佳工艺结果制得发酵后的红茶半成品，待测。

1.3.2 乳酸菌发酵红茶饮料工艺优化

1.3.2.1 单因素试验

[9-11]，最终选择果葡糖浆添加量、菌剂接种量、发酵温度和发酵时间4 个因素探究红茶饮料的发酵效果，以感官评分、pH值和酸度为评判指标。

1.3.2.2 正交试验

在单因素试验的基础上进行正交试验，以感官评分和酸度为指标确定最佳发酵工艺条件，正交试验因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels used for L9 (34) orthogonal array design

1.3.3 指标测定

感官评定参照文献[8]；pH值采用FE20型pH计测定；酸度测定：标准碱滴定法（以乳酸计）；茶多酚含量的测定：酒石酸亚铁比色法[12]；游离氨基酸总量的测定：茚三酮比色法[13]；饮料中咖啡因的测定：高效液相色谱法[14]。以上每个样品均重复3次实验。

1.3.4 抗氧化能力的测定

1.3.4.1 FRAP的测定

根据FRAP测定试剂盒说明书，每个样品重复3次实验，用酶标仪进行测定。

1.3.4.2 ABTS＋·清除能力的测定

根据ABTS＋·试剂盒说明书，每个样品重复3次实验，用酶标仪进行测定。

1.3.4.3 DPPH自由基清除能力的测定[15-16]

标准曲线：分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的VC溶液0.1mL，再加入3.9 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，混匀后避光放置30 min用无水乙醇作参比液，在517 nm波长处测定吸光度A，然后测定3.9 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液与0.1 mL无水乙醇混合后的吸光度A0。以VC溶液浓度为横坐标，DPPH自由基清除率为纵坐标，建立回归方程为y＝142.93x-4.64，R2＝0.999。DPPH自由基清除率的计算见公式（1）：

样品测定：以去离子水分别配制质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的目标样品溶液，吸取样品溶液0.1mL，后续步骤同上。样品溶液DPPH自由基清除能力表示为每毫升样品中VC当量，每个样品重复3次实验。

1.3.4.4 羟自由基清除能力的测定

参照文献[17-18]的方法并加以改进，在试剂管中加入1 mL 0.75 mol/L邻二氮菲无水乙醇溶液、2 mL 0.15 mol/L磷酸盐缓冲溶液、1 mL蒸馏水，充分混匀后，加入1 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，混匀后加入1 mL质量分数0.01%的H2O2溶液，37℃水浴60 min后，用1 cm比色皿在536 nm波长处测得损伤管的吸光度A2。用1 mL待测液代替蒸馏水于536 nm波长处测得样品管的吸光度A3。用1 mL蒸馏水代替H2O2溶液，在536 nm波长处测得未损伤管的吸光度A1。空白管：1 mL PBS溶液＋2 mL蒸馏水。按公式（2）计算样品对羟自由基清除率：

标准曲线绘制：配制质量浓度为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的VC溶液，作为待测液备用。以VC溶液浓度为横坐标，羟自由基清除率为纵坐标，建立回归方程为y＝193.3x-30.64，R2＝0.997。

样品测定：以去离子水分别配制质量浓度为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/mL的目标样品溶液，作为待测液按上述方法操作。样品溶液羟自由基清除能力以VC当量表示，每个样品重复3次实验。

1.3.5 香气成分测定[8]

取样品溶液约8 mL，置于20 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex纤维头的手动进样器，在60 ℃顶空萃取30 min后，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口中，热解吸5 min。

色谱条件：色谱柱：HP-5；升温程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至170 ℃，保持3 min，以6 ℃/min升至210 ℃，再以15 ℃/min升至230 ℃，保持1 min；载气（He）流速1 mL/min，进样口温度250 ℃，进样方式：不分流，溶剂延迟时间为1 min。

质谱条件：电子电离源，电子能量70 eV；离子源温度230℃，接口温度280 ℃；质量扫描范围m/z 20～450。

1.4 数据处理

实验均重复3 次，以 ±s表示，采用SPSS 17.0分析数据，采用Origin 9.0作图。气相色谱-质谱定性分析通过Agilent Mass Hunter来完成实验数据的采集和分析，并通过CAS号及配比度确定风味物质的种类；定量分析采用Agilent Mass Hunter色谱工作站软件，根据色谱图保留峰面积计算出各种香气成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵红茶饮料工艺优化

2.1.1 单因素试验结果

2.1.1.1 果葡糖浆添加量的影响

图1 果葡糖浆添加量对发酵红茶的影响Fig. 1 Effect of high fructose corn syrup concentration on pH and sensory score of fermented black tea

果葡糖浆主要由葡萄糖和果糖组成，其中葡萄糖可以作为乳酸菌生长的碳源，而果糖可提升发酵饮料的清香、爽口感，因此其添加量直接影响发酵饮料的品质。糖浆添加量太少，菌体生长状态不佳导致饮料发酵特点不明显，添加量太多，糖度太高，会使饮料太过甜腻。如图1所示，随着添加量的增加，酸度呈现上升趋势，pH值呈现下降趋势，感官评分先上升后下降，添加量为6%时感官评分最高。

2.1.1.2 菌剂接种量的影响

菌剂接种量是决定饮料发酵效果的直接因素，接种量太少会延长发酵周期，酸度不够使发酵风味不足且容易受到杂菌污染；接种量太多，菌体快速繁殖，易出现自溶现象，破坏产品风味[19]。如图2所示，随着接种量的增加，菌体产酸量增加，酸度快速上升，而pH值也随之下降，从4.7降至3.15。感官评分随着接种量的增加先上升后下降，在0.2%时分数最高，故选择0.2%为最佳接种量。

图2 菌剂接种量对发酵红茶的影响Fig. 2 Effect of inoculum amount on pH and sensory score of fermented black tea

2.1.1.3 发酵温度的影响

图3 发酵温度对发酵红茶的影响Fig. 3 Effect of temperature on pH and sensory score of fermented black tea

由图3可知，随着发酵温度的升高，pH值随之升高，酸度随之下降。植物乳杆菌最适生长温度一般为30～35 ℃左右，而在红茶这个复杂的环境中，发酵体系更适合低温发酵，感官评分结果也说明稍低温度发酵的饮料接受性更好，故选32 ℃为最佳发酵温度。

2.1.1.4 发酵时间的影响

发酵时间也是影响发酵产品的口感和风味的因素之一。发酵时间短，饮料风味不足，发酵时间过长，菌体大量死亡，产品闷熟味明显。由图4可知，饮料发酵48 h前pH值一直在下降，48 h后pH值趋于稳定后期小幅度回升，酸度反之，发酵48 h时平均感官评分最高，选为最佳发酵时间。

图4 发酵时间对发酵红茶的影响Fig. 4 Effect of fermentation time on pH and sensory score of fermented black tea

2.1.2 正交试验结果

表2 正交试验设计及结果Table 2 L9 (34) orthogonal array design with experimental values of response variables

如表2所示，由极差分析可知，4 个因素对红茶饮品感官评分影响主次顺序为菌剂接种量＞果葡糖浆添加量＞发酵时间＞发酵温度，正交试验优化最佳组合为A3B3C2D2。对酸度影响主次顺序为果葡糖浆添加量＞菌剂接种量＞发酵温度＞发酵时间，正交试验优化最佳组合为A3B3C3D2。对2 个组合进行验证实验，由表3可知，两组实验各指标差别不显著，考虑到生产成本，最终选择A3B3C2D2为最优组合，即果葡糖浆添加量8%、菌剂接种量0.3%、发酵温度32 ℃、发酵时间48 h。

表3 验证实验结果Table 3 Results of verification experiments

2.2 乳酸菌发酵红茶饮料发酵前后成分变化结果

表4 红茶饮料发酵前后成分变化Table 4 Changes in components of black tea before and after fermentation

茶多酚、咖啡碱、茶氨酸是茶叶中的重要功能性成分，对茶饮料的品质有着重要影响。茶汤中的茶多酚主要提供苦涩味[20]，咖啡碱虽是苦味物质[21]，但它能与茶汤中儿茶素类成分形成络合物，有利于提高茶汤整体的鲜爽度，而茶氨酸则是茶汤鲜味的呈味物质[22]。乳酸是植物乳杆菌的主要代谢产物，具有调节胃肠道菌群、保持微生态平衡的作用[23]。由表4可看出，红茶经植物乳杆菌发酵后，茶多酚的含量下降不显著，因为发酵过程中添加了果葡糖浆作为碳源，既能满足乳酸菌的生长需要，又减少了菌体对茶多酚的消耗；咖啡碱在发酵过程中能与酚类的氧化产物、蛋白质以及糖类等发生络合反应导致自身含量降低，故发酵后有一定的下降；茶氨酸较发酵前显著上升（P＜0.05），这与许原[24]、王小军[25]等的研究结果一致；红茶是全发酵茶，发酵前不含乳酸，发酵后乳酸含量显著上升（P＜0.05），说明植物乳杆菌在此环境下发酵性能良好。

2.3 抗氧化能力的测定结果

2.3.1 FRAP的比较

以FeSO4溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到回归方程为y=0.314x＋0.044，R2=0.9992，0.15～1.5 mmol/L范围内线性较好。

将所测的样液吸光度代入方程，最终求得样液的总抗氧化活性。样品的总抗氧化能力以FRAP值表示：1 FRAP单位=1mmol/L FeSO4，即每升样品的总抗氧化能力相当于FeSO4的物质的量（以毫摩尔计），结果如表5所示。红茶发酵前后的FRAP值均较高且发酵前后无显著变化（P＞0.05），说明发酵红茶饮料对FRAP有很强的还原能力。

表5 FRAP的总抗氧化能力Table 5 FRAP activity of non-fermented and fermented black tea

2.3.2 ABTS＋·清除能力的比较

ABTS＋·清除能力用Trolox当量抗氧化能力（troloxequivalent antioxidant capacity，TEAC）来表示，对Trolox作标准曲线得到方程y＝-0.651 5x＋0.933 5，R2=0.999 4，0.15～1.5mmol/L范围内线性较好。由表6可知，红茶发酵前后对ABTS＋·的清除活性均较高，TEAC值均高于1.2 mmol/L，发酵前后抗氧化能力变化不显著（P＞0.05），发酵后的红茶饮料依然保持了较高的抗氧化性。

表6 ABTS＋·的抗氧化能力Table 6 ABTS＋radical scavenging capacity of non-fermented and fermented black tea

2.3.3 红茶发酵前后DPPH自由基清除能力比较

图5 红茶发酵前后清除DPPH自由基清除能力Fig. 5 DPPH scavenging ability of non-fermented and fermented black tea

DPPH-乙醇溶液中加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，颜色由紫色向黄色变化，在517 nm波长处的吸光度变小，变小的程度与自由基被清除的程度呈定量正相关关系。本实验DPPH自由基清除能力以VC当量表示，如图5所示，发酵前后的自由基清除能力随样品浓度增加而增强，样品溶液体积为1 mL时，发酵前后VC当量分别为0.49 mg/mL和0.41 mg/mL，下降了16.3%。经植物乳杆菌发酵的红茶对DPPH自由基的清除能力稍低于未发酵的饮料，但仍保持较高的清除率。

2.3.4 红茶发酵前后羟自由基清除能力比较

羟自由基是体内的活性氧，具有极强的氧化性，可引起许多病理变化，如造成生物体内核酸、蛋白质、脂质等的氧化损伤，导致细胞的代谢紊乱、衰老死亡[26]。本实验利用Fenton反应，检测发酵前后红茶对羟自由基的清除效果，羟自由基清除能力以VC当量表示。如图6所示，红茶发酵前后随着样品溶液体积的增加，羟自由基清除能力逐渐增强。当样品溶液体积为0.6 mL时，红茶发酵前后VC当量分别为0.59 mg/mL和0.57 mg/mL，发酵后较发酵前有轻微下降，但下降幅度不大。

图6 红茶发酵前后羟自由基清除能力Fig. 6 Hydroxyl radical scavenging ability of non-fermented and fermented black tea

2.4 发酵红茶香气成分分析

表7 发酵红茶饮料挥发性风味成分Table 7 Volatile flavor components of non-fermented and fermented black tea

由表7可知，红茶在发酵前后的风味物质有明显变化，发酵前共鉴定出18 种物质，其中醇类8 种，酮类3 种，醛类和碳氢类各2 种，酯类、酚类、含氮化合物各1 种。主要香气成分为醇类，其次是酮类物质，分别占香气成分总量的87.04%和6.12%，其中含量较高的是芳樟醇和香叶醇，均是红茶主体香气成分[27-28]；发酵后共鉴定出29 种物质，其中醇类9 种，酮类和碳氢类各5 种，酯类和酚类各3 种，醛类2 种，酸类和含氮化合物各1 种。醇类、酮类物质相对含量依然较高，分别为84.07%和8.58%，酮类、酸类、碳氢类物质含量较发酵前均有增加。新出现的11 种成分主要为酮类和碳氢类，其中庚醛、β-紫罗、β-大马烯酮、植物醇为红茶的香气物质[29-30]，发酵前检出含量较少，说明发酵过程中增加了主体茶香。新风味物质中β-松油醇具有紫丁香味，肉桂酸乙酯呈淡的持久的肉桂和甜蜂蜜香味，异戊酸香叶酯具有果香，这些物质协同作用，使发酵红茶饮料香气更加丰富。

3 讨论与结论

本研究探讨了植物乳杆菌NCU177发酵红茶饮料的制作工艺，并采用常规理化分析及气相色谱-质谱法测定了发酵前后成分的变化。结果表明，果葡糖浆添加量8%，接种量0.3%，32 ℃发酵48 h后的红茶饮料，酸度和氨基酸含量显著上升，酸度从（0.01±0.01）g/L增加到（0.89±0.06）g/L，氨基酸含量提升了13%，茶多酚和咖啡碱成分略有损失；4 种体外抗氧化模型表明，发酵后红茶对部分自由基的清除能力稍有降低，但能保持较强的抗氧化能力；通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱法分析发酵饮料的香气成分，发酵前后鉴定出主要香气成分分别为18 种和29 种，新出现的11 种物质以酮类和碳氢类为主，发酵后醇类、酮类的相对含量依然较高，分别为84.07%和8.58%，成分含量增加的有酮类、酸类和碳氢类物质，分别提升了2.46%、0.39%和0.97%。

通过初步研究乳酸菌发酵对红茶饮料的影响，可以看出，植物乳杆菌发酵红茶饮料营养成分比较丰富，抗氧化能力较强且发酵后的香气成分含量更高且丰富，具有一定的开发利用价值。但在研究中也有一定的局限，如部分活性成分的降低可能对抗氧化能力有一定影响，后续可进一步对儿茶素类在发酵过程中的变化进行深入探讨，以期确定影响抗氧化活性的具体酚类物质。目前针对乳酸菌对茶风味形成机理研究处于空白，其对香型构成的作用仍需进一步研究。

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Effects of Lactic Acid Bacterial Fermentation on Nutritional Components, Aroma Components and Antioxidant Activity of Black Tea Beverage

LIU Jiaqi, PENG Zhen, XIONG Tao*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Nanchang University,Nanchang 330047, China)

This study determined the contents of tea polyphenols, theanine, caffeine and lactic acid in non-fermented and Lactobacillus plantarum fermented black tea beverage by ferrous tartrate colorimetry, nihydrin colorimetry and alkaline titration. Four in vitro antioxidant models were used to study the antioxidant activity. Also, the major aroma components were analyzed by headspace solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry (HSSPME-GC-MS). It was shown that after fermentation, the contents of tea polyphenols and caffeine in black tea beverage decreased slightly but theanine and lactic acid increased significantly (P ＜ 0.05). Moreover, the scavenging capacity against some free radicals declined slightly. The GC-MS analysis showed that the contents of some volatile flavor components such as alcohols and ketone significantly increased after fermentation, contributing to enhancing the aroma quality of black tea.

lactic acid bacteria; fermentation; black tea beverage; antioxidant activity; flavor components

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724021

TS272.7

A

1002-6630（2017）24-0130-07

刘佳奇, 彭珍, 熊涛. 乳酸菌发酵对红茶饮料营养成分、香气成分及抗氧化活性的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(24)∶130-136. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724021. http∶//www.spkx.net.cn

LIU Jiaqi, PENG Zhen, XIONG Tao. Effects of lactic acid bacterial fermentation on nutritional components, aroma components and antioxidant activity of black tea beverage[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 130-136. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724021. http∶//www.spkx.net.cn

2017-01-10

江西省蔬菜产业技术体系岗位专家项目（JXARS-06）；国家农业科技成果转化项目（赣财农指[2014]120号）；

国家自然科学基金地区科学基金项目（31560449）

刘佳奇（1990—），女，硕士研究生，研究方向为功能食品发酵。E-mail：ncdxljq@163.com

*通信作者：熊涛（1970—），男，教授，博士，研究方向为益生菌及大宗果蔬高值化利用。E-mail：xiongtao0907@163.com