单萜烯物质检测方法建立及自选酵母KDLYS9-16对单萜烯产生的影响

李 艳，周立华

单萜烯物质检测方法建立及自选酵母KDLYS9-16对单萜烯产生的影响

李 艳1,2，周立华1

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北 石家庄 050018）

采用液液萃取法结合气相色谱氢火焰离子检测器建立一种可同时检测葡萄酒中13 种游离态单萜烯类物质的方法，并采用所建方法检测了商品菌SC和自选菌KDLYS9-16两种酿酒酵母发酵的河北省沙城和昌黎2 个产区的赤霞珠和美乐葡萄酒中的单萜烯类物质。结果显示，方法的R2为0.996 7～0.999 3，检出限为0.580～1.073 mg/L，相对标准偏差为0.58%～3.18%，回收率为89.98%～107.34%。4 种葡萄酒中的单萜烯类物质质量浓度都比发酵前的葡萄汁中高，尤以采用自选高产β-D-葡萄糖苷酶酿酒酵母KDLYS9-16发酵的昌黎产区赤霞珠干红葡萄酒中最高，达到2.855 mg/L，比葡萄汁中增加约3.1 倍。赤霞珠葡萄及葡萄酒中单萜烯物质质量浓度比美乐葡萄高，沙城产区的2 种葡萄汁中单萜烯类物质质量浓度比昌黎的高，选用不同菌种发酵的葡萄酒中单萜烯物质质量浓度和种类不同。综上，本研究建立方法简单、灵敏性高、重复性好，可用于葡萄及葡萄酒中单萜烯类物质的检测。

液液萃取；气相色谱氢火焰离子检测器；单萜烯类物质；葡萄酒香气

萜烯类物质具有特殊的香气，是葡萄酒中重要的香气成分[1-4]，主要包括单萜烯类、倍半萜烯类以及二萜烯类化合物等[5]。葡萄酒中的香气成分主要以游离态和结合态香气前体物的形式存在，结合态物质本身没有香气，必须经过分解释放才能产生香气[6]。通常葡萄浆果中以葡萄糖苷键形式存在的结合态萜烯类香气物质的含量比游离态萜烯类的呈香物质丰富[7]。研究表明，结合态萜烯类香气糖苷物质是葡萄酒活性香气成分的储备库，比其对应的游离态配基多几倍，甚至几十倍[8]。β-D-葡萄糖苷酶对葡萄中与糖苷结合的萜类物质进行水解，从而释放糖苷及单萜烯、倍半萜烯类等提高葡萄酒的香气[9-11]，进而增加葡萄酒的香气物质含量，提高葡萄酒的感官品质。

目前对于单萜烯的检测方法及种类还不够全面，对高产β-D-葡萄糖苷酶的酿酒酵母对单萜烯类物质产生的影响的研究较少。本研究是在建立一种以葡萄酒为基础的检测单萜烯物质的方法，并对高产β-D-葡萄糖苷酶自选酵母的单萜烯的产生影响进行了研究，为今后对该菌的商业应用提供数据支持。

本研究建立一种可同时检测葡萄酒中13 种单萜烯类物质的方法，并对选自不同产区的不同酿酒葡萄，采用自选高产β-D-葡萄糖苷酶的酿酒酵母和商品酵母菌发酵的葡萄酒中单萜烯类物质进行检测，判断检测方法的准确性和产区、葡萄品种以及酵母菌对葡萄酒中单萜烯类物质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒葡萄：美乐和赤霞珠葡萄，2015年葡萄成熟季节，分别采摘于河北省昌黎和沙城葡萄酒产区，基础检测数据见表1。

表1 酿酒葡萄基础数据Table 1 Basic data of wine grapes

酿酒酵母KDLYS9-16：自选高产β-D-葡萄糖苷酶酿酒酵母，本研究室分离筛选于河北省沙城葡萄酒产区，GenBank登录号KX119943；SC：商品酿酒酵母购自意大利Esseco公司。

α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、D-（＋）-樟脑、L-薄荷醇、右旋香芹酮、（Z）-香叶基丙酮、（E）-香叶基丙酮（均为分析纯） 成都艾科达化学试剂有限公司；芳樟醇、香叶醇（均为分析纯） 东京化成工业株式会社；香茅醇、橙花醇（均为分析纯） 美国Acros Organics USA公司；α-萜品醇（分析纯） 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；二氯甲烷、偏重亚硫酸钾（均为分析纯） 天津市永大化学试剂有限公司；HE果胶酶（食品级） 法国Laffort公司。

1.2 仪器与设备

GC 7820A配有氢火焰检测器 美国安捷伦公司；RE52CS-1旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DC-12氮吹仪 上海安谱科技仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干红葡萄酒酿造过程

干红葡萄酒酿造采用传统工艺于实验室酿造，基本工艺流程为[12]：酿酒葡萄→分选→除梗→手工破碎→加入果胶酶和SO2（果胶酶加量40 mg/L，SO2加量50 mg/L），室温浸渍过夜→接种酵母酒精发酵（酵母菌接种量1×106个/mL）→压榨分离皮渣→葡萄原酒去沉淀→过滤→封存检测。

1.3.2 单萜烯类物质标准曲线的建立

以二氯甲烷为溶剂配制单萜烯类物质标准溶液，质量浓度为α-蒎烯464 mg/L、β-蒎烯828 mg/L、月桂烯778 mg/L、D-（＋）-樟脑634 mg/L、芳樟醇858 mg/L、L-薄荷醇748 mg/L、α-萜品醇494 mg/L、右旋香芹酮558 mg/L、香茅醇494 mg/L、橙花醇496 mg/L、（Z）-香叶基丙酮319 mg/L、香叶醇354 mg/L和（E）-香叶基丙酮478 mg/L的混合标准溶液原液，然后稀释1、2、5、10、50、100 倍和1 000 倍，利用这7 个梯度稀释后的溶液建立标准曲线，进行气相色谱氢火焰离子检测器（gas chromatography-flame ion detector，GC-FID）分析，以单萜烯类物质质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标画图。

1.3.3 单萜烯类物质的萃取[13]

分别取葡萄果汁和葡萄酒各50 mL，倒入250 mL分液漏斗中，加入等体积二氯甲烷萃取24 h，萃取过程中反复振荡达到充分混合，静置分层后分离萃取液和萃余液，萃取液倒入圆底烧瓶中，封口待用。萃余液再分别加入30 mL溶剂进行第2次和第3次萃取，均萃取24 h。将3 次萃取液合并，用旋转蒸发仪浓缩至3 mL左右，转入5 mL试管中，再用2 mL溶剂洗涤圆底烧瓶，洗液一并倒入试管中，氮吹至1 mL以下，再补充溶剂至1mL，用0.45 μm膜过滤，滤液用于香气物质检测，此样品为浓缩50 倍。每个样品平行检测3 次。1.3.4 GC-FID分析条件

Agilent 7820A GC-FID，色谱柱为HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为氮气，流速1 mL/min；升温程序：初始温度为50 ℃，保持10 min；以3 ℃/min升温至140 ℃，保持10 min；以5 ℃/min升温至200 ℃，保持1 min；然后以10 ℃/min升至250 ℃，保持1 min。

色谱参数[14]：1 μL样品不分流进样，进样口温度250 ℃；检测温度280 ℃；尾吹气流量25 mL/min；氢气流量40 mL/min；空气流量400 mL/min。

1.3.5 标准曲线参数的测定

回收率用来评价测定方法的准确度，一般测定方法为向已知物质质量浓度的样品中加入纯目标物质，利用仪器测定浓度，然后进行分析，按公式（1）计算[15-16]：

检出限为所建立的方法所能检测到的目标物质的最低质量浓度，本研究检出限的测定时通过不断稀释标准样品，直至无法检测到为止，此时的质量浓度为该物质的检出限，为该物质检测与否的一个界点。

1.3.6 葡萄汁和葡萄酒中单萜烯类物质质量浓度测定

本研究检测的样品包括河北省沙城产区和昌黎产区的美乐葡萄和赤霞珠葡萄，以及分别采用商品酵母菌SC和自选高产β-D-葡萄糖苷酶的酿酒酵母KDLYS9-16酿造的4 种干红葡萄原酒，共计12 个样品，每个样品做3 个平行，定量时取3 次测定结果的平均值，按公式（2）计算：

葡萄汁发酵后的葡萄酒中单萜烯类物质相对增加量按公式（3）计算：

1.4 数据处理

利用Origin 8.0软件对实验数据进行线性回归处理。

2 结果与分析

2.1 单萜烯类物质标准曲线

以单萜烯类物质质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，使用Origin 8.0软件进行线性回归，得到GC-FID分析线性关系，结果见表2。13 种单萜烯类物质混合标准品的GC图见图1。

表2 单萜烯类物质的GC-FID分析结果Table 2 Figures of merit of GC-FID for detecting monoterpenes

图1 单萜烯标准品分离GC图Fig. 1 GC Chromatogram for standard mixture of monoterpenes

由图1可知，通过仪器数据计算13 种单萜烯类物质的标准品分离度都大于1.5，且峰形窄尖，分离效果较好，符合分离检测的标准，说明检测方法适于对这13 种单萜烯类物质进行分析检测。

由表2可知，13 种单萜烯类物质标准曲线的线性关系较好，R2在0.996 7～0.999 3之间，说明线性方程可用于物质定量。

方法的检出限一般为该物质质量浓度基线噪声的3 倍，在实验中可以反映对待测目标物质的灵敏性，测得的检出限越小，说明仪器方法对所要测定的物质灵敏性越高，所建方法对目标物质比较适合[17-18]。表2中各种单萜烯类物质的检出限在0.580～1.073 mg/L之间，满足检测要求，说明所建方法的灵敏性适合对目标物质的检测。方法的重复性可以用目标物质的相对标准偏差（relative standard devition，RSD）来表示，RSD越小说明重复性越好，所建方法的各种单一物质的RSD都在0.58%～3.18%之内，RSD较小，说明方法的重复性较好。

所建方法的回收率为89.98%～107.34%，说明该方法对物质的定性与定量均较准确，适于对单萜烯类物质的检测。

2.2 葡萄汁和葡萄酒中单萜烯类物质的测定结果

表3 葡萄汁和葡萄酒中单萜烯类物质的质量浓度Table 3 Monoterpene concentrations in grape juice and wine mg/L

图2 葡萄汁与葡萄酒中13 种单萜烯类物质质量浓度的变化Fig. 2 Comparative concentrations of 13 monoterpenes in grape juice and wine

萜烯及C13-降异戊二烯类物质对葡萄酒品种香气的形成起到了决定关键的作用，这类物质通常都具有浓郁的香气和较低的感官阈值[19]，这些物质是酿酒葡萄原料中潜在的非常重要的香气成分，对葡萄酒品质起着举足轻重的作用。由表3和图2可以看出，沙城和昌黎产区的美乐和赤霞珠葡萄汁、分别经过SC和KDLYS9-16酵母发酵后的美乐和赤霞珠干红葡萄酒等12 个样品中分别检测到5、7、9、6、8、11、4、7、10、7、7 种和11 种单萜烯类物质，发酵后葡萄酒中的单萜烯物质种类和总质量浓度普遍明显增加，且自选菌高于商品菌。由表3可以看出，经自选菌发酵的昌黎赤霞珠干红葡萄酒中单萜烯类物质质量浓度增加最多，达到308.88%，而经SC发酵后的沙城美乐葡萄酒中质量浓度增加最高仅为90.80%，由此表明自选菌在增香上优于商品菌，具有很好的增香效果，并且对赤霞珠干红酒的作用要好于对美乐葡萄酒的增香作用。

2.2.1 自选菌对沙城产区葡萄酒中单萜烯质量浓度的影响

沙城产区美乐葡萄经过2 种酵母的发酵作用后，单萜烯类物质的质量浓度和种类数都呈现了增加的趋势，葡萄汁中的总质量浓度为0.502 mg/L，经过SC和KDLYS9-16酵母发酵后分别增长为0.959 mg/L和1.416 mg/L。在葡萄汁和葡萄酒中均检测到芳樟醇、α-萜品醇、香茅醇和香叶醇，且质量浓度有明显增大，尤其芳樟醇的质量浓度在KDLYS9-16发酵后的葡萄酒中为0.391 mg/L，说明这些物质在葡萄中天然存在一部分游离态，同时也存在结合态。结合态的物质经酵母的发酵作用而水解为游离态，使质量浓度增加；月桂烯和（Z）-香叶基丙酮只在经KDLYS9-16发酵后的葡萄酒中被检出，说明了自选菌发酵过程中释放的酶可以水解月桂烯和（Z）-香叶基丙酮结合态物质释放单体，这2 种物质是典型的油脂香型物质。

沙城产区赤霞珠葡萄汁和葡萄酒中单萜烯物质质量浓度明显高于美乐葡萄，葡萄汁中总质量浓度为0.750 mg/L，商品菌SC发酵后总质量浓度达到1.142 mg/L，而KDLYS9-16发酵后总质量浓度达到2.454 mg/L，在果汁的基础上提高了227.05%。2-茨酮、芳樟醇、α-萜品醇、香茅醇、橙花醇和香叶醇是葡萄汁和葡萄酒中都具有的，在葡萄汁中芳樟醇的质量浓度最高为0.206 mg/L，经过自选菌发酵后增加了198%，达到0.614 mg/L，成为沙城产区赤霞珠葡萄酒中质量浓度最高的单萜烯物质，这些物质是阈值很低的物质[20-23]，使葡萄酒呈现了浓郁的玫瑰花香和果香[24-28]；L-薄荷醇、右旋香芹酮和（E）-香叶基丙酮仅在KDLYS9-16发酵的葡萄酒中被检出，说明该菌在发酵过程中产生的β-D-葡萄糖苷酶可以水解这3 种物质的结合态，释放出游离态单体物质，而SC酵母则不具备这种水解作用；此外，α-蒎烯、2-茨酮在美乐葡萄汁中则未被检出，而2 种发酵酒中都被检出，说明它们是发酵的产物，从质量浓度上来说，自选菌高于商品菌。

沙城产区的美乐葡萄和赤霞珠葡萄经过2 种酵母的发酵作用后，单萜烯类物质质量浓度都增加，以自选菌发酵的葡萄酒中增加显著，尤其赤霞珠葡萄单萜烯类物质质量浓度从葡萄汁中的0.750 mg/L增加为葡萄酒中的2.454 mg/L，且种类从6 种增加到11 种。通过实验分析可知，自选高产β-D-葡萄糖苷酶酵母菌KDLYS9-16对沙城产区的美乐和赤霞珠葡萄酒增香作用优于商品菌SC。

2.2.2 自选菌对昌黎产区葡萄酒中单萜烯质量浓度的影响

昌黎美乐葡萄汁及葡萄酒中总共检测出10 种单萜烯物质，有4 种为3 个样品所共有，分别为芳樟醇、香茅醇、橙花醇和香叶醇，其中芳樟醇在样品中质量浓度最高，在KDLYS9-16发酵酒中质量浓度最高为0.645 mg/L，是葡萄汁中质量浓度的3.12 倍。香叶醇从葡萄汁经过SC酵母发酵后质量浓度没有明显增加，而经过KDLYS9-16发酵后质量浓度大量增加，从0.093 mg/L增加到0.207 mg/L，增加了122.58%；月桂烯、L-薄荷醇和（Z）-香叶基丙酮仅在KDLYS9-16的发酵酒中被检测到，总质量浓度为0.074 mg/L，这些物质分别具有香脂香气、薄荷香气和香叶气息[29]；另外，α-蒎烯、2-茨酮和α-萜品醇是经过酵母发酵后产生，α-蒎烯的质量浓度在2 种菌的发酵酒中相差不大，说明该物质不会因β-D-葡萄糖苷酶的存在而急剧的增加。2-茨酮和α-萜品醇的质量浓度经KDLYS9-16发酵后增加，尤其α-萜品醇的质量浓度SC菌发酵酒中为0.077 mg/L，而KDLYS9-16发酵酒中0.318 mg/L，说明β-D-葡萄糖苷酶可以促进α-萜品醇由结合态水解为游离态。

由图2可以看出，昌黎产区赤霞珠经KDLYS9-16发酵后单萜烯的质量浓度增加最多，从葡萄汁中的0.698 mg/L增加到葡萄酒中的2.855 mg/L，相对增加量为309%，而对照菌SC酵母的发酵酒中的单萜烯物质质量浓度在葡萄汁的基础相对增加量为58.09%，变化不大。与其他实验组相似，芳樟醇无论在葡萄汁还是葡萄酒中单萜烯的质量浓度都最高，在经KDLYS9-16发酵后的葡萄酒中质量浓度高达0.825 mg/L，是葡萄汁中质量浓度的3.29 倍，由于其阈值为25 μg/L[30]，所以芳樟醇对昌黎赤霞珠亚种16发酵酒风味香气影响较大，使酒体花香比较突出，此外，香茅醇、α-萜品醇和香叶醇在KDLYS9-16发酵酒中的质量浓度也较高，仅次于芳樟醇，分别达到0.617、0.367 mg/L和0.305 mg/L，是葡萄汁中质量浓度的6.86、11.12 倍和2.40 倍，这3 种物质使KDLYS9-16发酵酒具有了花香、果香和青叶油香。α-蒎烯、月桂烯、L-薄荷醇、右旋香芹酮和（E）-香叶基丙酮仅存在于KDLYS9-16发酵酒中，在葡萄汁和SC发酵酒中未被检测到，说明这些物质是经KDLYS9-16在发酵过程中释放的酶水解相应的结合态物质而释放的；2-茨酮和橙花醇同时存在于葡萄汁和葡萄酒中，经过发酵后质量浓度全部升高，尤其在KDLYS9-16的发酵酒中质量浓度增加明显。

3 结 论

本研究建立了一种同时检测葡萄汁和葡萄酒中13 种单萜烯类物质的方法，先以有机溶剂二氯甲烷进行液液萃取，然后旋转蒸发、氮吹浓缩，再结合GC检测技术，对2 个产区的2 种葡萄的葡萄汁和经2 种菌发酵后的酒，共12 个样品进行了检测。结果显示：自选酿酒酵母KDLYS9-16在葡萄酒增香上相对于商品菌SC酵母具有明显的优势，使酒中单萜烯类物质质量浓度增加幅度较大，极大地促进了葡萄中结合态单萜烯前体物质水解成游离态单萜烯物质，且数据显示赤霞珠干红酒中的单萜烯质量浓度高于美乐葡萄酒。经自选菌发酵的昌黎赤霞珠干红葡萄酒中单萜烯类物质质量浓度增加最多，相对增加量为308.88%，而经SC发酵后的沙城美乐葡萄酒中相对增加量最高仅为90.80%，经过自选酵母发酵后的4 种葡萄酒中分别检测到9、11、10 种和11 种单萜烯物质，都高于相同发酵基质的SC发酵葡萄酒。这些都证明了自选酵母对单萜烯类物质在发酵过程种具有增加的作用，为今后对该菌的商业应用提供了数据支持。

实验结果表明，本研究所建对葡萄酒中13 种单萜烯的检测方法具有简单、灵敏性高、重复性好等优点，可以对葡萄及葡萄酒中的单萜烯物质进行定性定量测定。

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Establishment of a Method for the Detection of Monoterpene Compounds and Effect of Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-16 on Monoterpenes Production during Wine Fermentation

LI Yan1,2, ZHOU Lihua1
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China;2. Hebei R&D Center for Fermentation Engineering, Shijiazhuang 050018, China)

A method for simultaneously detecting 13 free monoterpene compounds in wine was established by liquid-liquid extraction coupled with gas chromatography with flame ionization detection (GC-FID). The monoterpene compounds in Cabernet Sauvignon and Merlot wines fermented by a commercial yeast strain SC or laboratory isolated Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-16 from two wine producing areas in Shacheng and Changli, Hebei province, respectively were detected by this method. The results showed that the calibration curves exhibited a correlation coefficient (R2) of 0.996 7–0.999 3, and the limits of detection (LOD) varied between 0.580 and 1.073 mg/L. The recoveries were in the range of 89.98%–107.34% with relative standard deviations of 0.58%–3.18%. All four wines were higher in monoterpenes than grape must. The Cabernet Sauvignon dry red wine fermented by Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-16 from Changli had the highest monoterpene concentration of 2.855 mg/L among the four wines, which was about 3.1 folds higher than that of grape must. Cabernet Sauvignon wine and must had a higher monoterpene concentration than Merlot wine and must. For both cultivars, the monoterpene concentration was higher in Shacheng must than in Changli must. The types and concentrations of monoterpenes in wine varied with cultivar. In conclusion, the established method in this study is simple,sensitive, and reproducibile and can be used for the detection of monoterpene compounds in grape and wine.

liquid-liquid extraction; GC-FID; monoterpene compounds; wine aroma

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724020

TS261.1

A

1002-6630（2017）24-0124-06

李艳, 周立华. 单萜烯物质检测方法建立及自选酵母KDLYS9-16对单萜烯产生的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(24):124-129.

10.7506/spkx1002-6630-201724020. http://www.spkx.net.cn

2017-03-30

河北省自然科学基金项目（C2011208028）

李艳（1958—），女，教授，学士，研究方向为传统发酵工程创新技术、葡萄酒和果酒酿造。

E-mail：Lymdh5885@163.com

LI Yan, ZHOU Lihua. Establishment of a method for the detection of monoterpene compounds and effect of Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-16 on monoterpenes production during wine fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 124-129. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724020. http∶//www.spkx.net.cn