盐芥根际土壤微生物DNA提取方法的比较

王淑娟+王+君+邓方宁+姜翠凤+李庆达

摘 要：目的：实验通过采集黄河三角洲地区耐盐植物盐芥的根际土壤，采用Martin法、SDS法、高盐改进法3种方法提取根际土壤的总DNA，测定提取的纯度和浓度。方法：对以上3种方法进行改进后，获得了较高的DNA质量和提取率。结果：采用SDS加蛋白酶K和溶菌酶的方法，提取总DNA的浓度为145.3μg/g，A260/A280为1.82；在高盐改进法中将样品反复冻融5次，提取总DNA的浓度为141.3μg/g，A260/A280为1.81。优化后的提取方法均得到了纯度较高的DNA样品，本实验为后续微生物多样性的研究提供了基础。

關键词：盐芥；根际土壤；总DNA

中图分类号 Q89 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）22-0042-02

Abstract：Objective：Total DNA of the rhizosphere soil from the salt-tolerant plants Thellungiella salsugineain the Yellow River Delta was extracted by Martin method， SDS method and improved high-salt method. Method：Two modified methods were obtained. Conclusion：From the SDS method added with protease K and lysozyme， the concentration of total DNA was 145.3μg/g， A260/A280 was 1.82. After 5 times of frozen-melt treatments， 141.3μg/g total DNA concentration was obtained using improved high-salt method， A260/A280 was 1.81. These two methods got purified DNA samples， and provided the foundation for the further research of microbial diversity.

Key words：Thellungiella salsuginea；Rhizosphere soil；Total DNA

2000年，山东师范大学逆境植物实验室首次提议将盐生植物盐芥作为研究植物耐盐性的又一模式系统[1]。滨州地处黄河三角洲，濒临渤海，多盐渍土壤，适宜盐生植物盐芥的生长[1]。本实验采集了盐芥根际土壤，运用Martin法、SDS法、高盐改进法3种方法提取土壤中的总DNA，用核酸蛋白测定仪测定其纯度。通过对3种方法进行改良，获得了较高浓度和纯度的根际土壤总DNA，为后续微生物多样性的研究提供了基础。

1 材料与方法

1.1 实验主要试剂与药品 EDTA、Tris-HCl、CTAB、SDS、70%的乙醇、异丙醇、酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）、溶菌酶、蛋白酶K等一系列实验药品。

1.2 实验主要使用仪器 恒温振荡培养箱、核酸蛋白测定仪、台式高速冷冻离心机、Biorad凝胶成像系统、电泳仪。

1.3 实验样品 采取盐生植物盐芥的根际土壤。选取4个地点采集盐芥，每一个地点采集2株盐芥作为实验对象，把同一个采样点的2株盐芥根际土壤混合，做为实验样品，4℃冰箱中保存以备用。

2 实验方法

2.1 Martin法 称取1g土样分别加入4个5mL无菌离心管中，依次加入0.8g酸洗石英砂，3mLDNA提取液（100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸盐，1.5mol/L NaCl，1%的CTAB，pH=8）[2]，涡旋混匀后，在恒温震动培养箱中以225r/min分别震荡2h、4h、6h、8h后，在低温高速离心机中4℃下12000r/min离心15min，用移液枪取上清液移到1.5mL 离心管中，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）混匀，以12000r/min离心15min后，移到离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后室温沉淀过夜，4℃下12000r/min离心20min后，用70%的乙醇清洗2～3次，待晾干后加入30μL的TE溶解，-20℃保存。

2.2 SDS法[3] 称取1g土样分别加入4个5mL无菌离心管中，依次加入1.35mLDNA提取液（100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸盐，1.5mol/L NaCl，1%的CTAB，pH=8），4和5号离心管加入10μL蛋白酶K，6、7号离心管加入20μg/mL的溶菌酶和10μL蛋白酶K，在恒温震动培养箱中以225r/min震荡2h，再加入0.15mL的20%SDS，60℃水浴2h，每隔15min轻轻颠倒几下，水浴结束后室温12000r/min离心15min，用移液枪收集上清于1.5mL离心管中，在沉淀中再加入0.45mL的DNA提取液和50μL20%的SDS，在振荡器上涡旋15s，60℃水浴15min，室温下12000r/min离心10min后，用移液枪取上清液移到1.5mL离心管中，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混匀，以12000r/min离心15min后，移到离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后室温沉淀过夜，4℃下12000r/min离心20min后，用70%的乙醇清洗2～3次，待晾干后加入30μL的TE溶解，-20℃保存。

2.3 高盐改进法 称取1g土样分别加入3个5mL无菌离心管中，依次加3mL DNA提取液（100mmol/L Tris-HCL，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸盐，1.5mol/L NaCl，1%的CTAB，pH=8），涡旋混匀，加入20μL蛋白酶K，37℃水浴30min，中间混匀数次，然后加入0.3mL 20% SDS在60℃下水浴2h，每隔15min混匀颠倒一次，然后放入-70℃中冷冻15min。再放入60℃水浴中融化15min，分别反复3次，5次，7次。冻融结束后4℃下12000r/min离心15min，移到1.5mL 离心管中，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇（25：24：1）混匀，12000r/min离心15min后移到离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后室温沉淀过夜，4℃下12000r/min离心20min后，用70%的乙醇清洗2～3次，待晾干后加入30μL的TE溶解，-20℃保存[4，5]。endprint

2.4 根际土壤总DNA的浓度分析 将所提取到的总DNA各吸取1μL，用核酸蛋白测定仪下测定其浓度和纯度。

3 结果与分析

3.1 根际土壤总DNA的提取 将运用改良的Martin法、SDS法、高盐改進法对提取出来的的总DNA用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。结果如图1所示，泳道1、2、3分别是高盐改进法反复冻融3次，5次，7次的结果，发现反复冻融5次时DNA浓度较高（泳道2）；泳道4，5是SDS法中添加蛋白酶K，泳道6，7是SDS法中添加蛋白酶K和溶菌酶，发现后者浓度较高（如泳道6），但出现拖尾，说明DNA出现断裂。泳道8，9，10和11是采用Martin法分别振荡2h，4h，6h和8h时的结果，发现振荡6h和8h得到的样品浓度较高（泳道10和11），但是振荡8h的条带有明显的拖尾，说明振荡时间太久使得DNA断裂。

3.2 根际土壤总DNA的分析 将提取的DNA用核算分析仪测定浓度和纯度，如表1所示。结果表明，2种改良方法获得了较高的DNA浓度和纯度。一种是改良的SDS法，即在SDS法中加蛋白酶K和溶菌酶，提取总DNA的浓度为145.3μg/g，A260/A280为1.82；第二种是改良的高盐法，即在高盐改进法中将样品反复冻融5次，提取总DNA的浓度为141.3μg/g，A260/A280为1.81。

4 结论

微生物多样性的研究是基于根际土壤总DNA的基础上进行的，因此，选取有效简便的方法成为根本。本实验对Martin法、SDS法、高盐改进法3种总DNA提取方法进行了改良，高效提取盐芥根际土壤种的总DNA，对后续微生物多样性分析实验奠定了基础。

参考文献

[1]李妍.耐盐研究模式植物——盐芥[J].生物学通报，2007，42（02）：22-23.

[2]陈旭玉，周亚奎，郑服从，等.橡胶林土壤微生物2种DNA提取方法的比较[J].热带农业科学，2008， 28（03）：22-23.

[3]张海燕，王彩虹，龚明福，等.一种简单有效且适于土壤微生物多样性分析的DNA提取方法[J].生物技术通报，2009，25（08）：49-50.

[4]Tebbe CC， Vahjen W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast[J]. Appl Environ Microbiol，1993，59（2）：657-665.

[5]顾华杰，李玉祥，赵明文，等.几种水稻田土壤微生物总DNA提取方法的比较[J].江苏大学学报（医学版），2005，15（04）：256-258.

（责编：张宏民）endprint