大孔吸附树脂分离纯化2′-脱氧腺苷

吴 明 杰， 杜 杰， 崔 励

( 大连工业大学 轻工与化工学院, 辽宁 大连 116034 )

大孔吸附树脂分离纯化2′-脱氧腺苷

吴 明 杰， 杜 杰， 崔 励

( 大连工业大学 轻工与化工学院, 辽宁 大连 116034 )

主要研究了大孔吸附树脂分离纯化生物转化液中的2′-脱氧腺苷的工艺条件。通过静态吸附法考察了7种不同类型树脂的吸附能力，最适吸附树脂为D101，最佳吸附pH 8.0，确定了先用0.1 mol/L Na2CO3洗脱再用体积分数30%乙醇洗脱的洗脱工艺。通过动态吸附实验确定了大孔吸附树脂分离纯化2′-脱氧腺苷的最佳工艺条件：上样体积流量2.0 mL/min，洗脱体积流量1.5 mL/min，洗脱剂依次为4.5倍柱体积的0.1 mol/L Na2CO3溶液、3倍柱体积的体积分数30%乙醇。在该条件下，质量分数78.7% 的2′-脱氧腺苷收率为93.9%。

脱氧腺苷；大孔吸附树脂；纯化

0 引 言

2′-脱氧腺苷是一种天然脱氧核苷，既是生化药物和基因工程研究的重要原材料,又是生产抗肿瘤和抗病毒核苷类药物的重要中间体，因此在市场上有广泛需求[1-2]。2′-脱氧腺苷可通过脱氧核糖核酸降解得到,但是由于DNA供应的不稳定,以及降解后产物复杂、分离困难等原因，该方法并不实用。脱氧腺苷也可通过化学合成法合成,但需要将一些基团保护与去保护以及糖基的活化反应，步骤复杂，且得到的是一对对映异构体，需要拆分等[3-4]。

以2′-脱氧胸苷为核糖基供体，腺嘌呤为碱基供体通过生物转化法制备2′-脱氧腺苷,只需要一步反应，避免了传统化学法的不足。其反应机理已有报道[5]。如何从成分复杂的发酵液中分离纯化出活性物质，继而对微生物药物实现商品化生产，非常重要[6-7]。大孔吸附树脂是20世纪60年代末发展起来的一类有机高聚物吸附剂，具有多孔网状结构和较好的吸附性能，在分离纯化苷、黄酮、皂苷、生物碱等成分方面已得到逐步应用，为吸附法提取微生物药物提供了新的途径[8-9]。本研究采用大孔吸附树脂法分离纯化生物转化液中的2′-脱氧腺苷，确定了分离纯化工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材 料

试剂：标准品2′-脱氧腺苷(dA)、胸腺嘧啶(T)、甲醇，色谱纯；其他试剂均为分析纯；生物转化液自制。

仪器：岛津高效液相色谱仪，UV检测器(SPD-10A)，C18反相柱(Φ4.6 mm×250 mm，5 μm)；pH计；离心机；真空抽滤泵；摇床；分析天平等。

1.2 方 法

1.2.1 生物转化液的制备及预处理

生物转化液的制备：60 mmol/L的脱氧胸苷(dT)，60 mmol/L的腺嘌呤(A)，6%的湿菌体，磷酸盐缓冲液作为标准反应混合物，在55 ℃下120 r/min振荡反应2 h，摩尔转化率约65%。其中底物腺嘌呤、副产物胸腺嘧啶为主要杂质，浓度分别约为20、15 mmol/L[10]。

预处理：将得到的生物转化液离心除去菌体,取上清液，4 ℃保存备用。

1.2.2 检测方法

用高效液相色谱仪进行分析。液相色谱操作条件：5 mmol/L磷酸盐缓冲液-甲醇(体积比85∶15)为流动相，体积流量为0.8 mL/min，吸收波长为254 nm，利用标准曲线确定2′-脱氧胸苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤的浓度。

2′-脱氧腺苷标准曲线回归方程：y=0.035 7x，R2=0.999 6。x为dA峰面积，10-3；y为dA质量浓度，mg/L。

胸腺嘧啶标准曲线回归方程：y=0.063 2x，R2=0.999 1。x为T峰面积，10-3；y为T质量浓度，mg/L。

腺嘌呤标准曲线回归方程：y=0.059 1x，R2=0.999 3。x为A峰面积，10-3；y为A质量浓度，mg/L。

1.2.3 树脂预处理

将7种树脂(717、D201、D290、HPD600、DM130、AB-8、D101)先用体积分数95%乙醇充分浸泡24 h，经检测无有机性物质后用去离子水洗至无醇味，在1 mol/L NaOH溶液中浸泡4 h，去离子水洗至中性，在1 mol/L HCl中浸泡4 h，去离子水洗至中性。若为阴离子型树脂则再在0.1 mol/L NaCl溶液中浸泡4 h，去离子水洗至中性[11]。

1.2.4 静态吸附与解吸

准确称取预处理好的树脂5.0 g(用滤纸吸干)，装入50 mL三角瓶中，加入11.0 mL预处理的生物转化液，20 ℃、120 r/min转速下振荡吸附15 h，HPLC法测定生物转化液及残液中2′-脱氧腺苷、腺嘌呤、胸腺嘧啶的浓度，计算dA、T、A的吸附率和单位质量树脂的dA吸附量。

吸附率=(ρ0-ρ1)/ρ0

(1)

吸附量=(ρ0-ρ1)V0/m

(2)

式中：ρ0为生物转化液中成分的初始质量浓度，mg/L；ρ1为吸附后残液中成分质量浓度，mg/L；V0为生物转化液体积，mL；m为湿树脂质量，g。

将吸附饱和的树脂滤出，吸干表面水分，加入与原生物转化液相同体积的20%乙醇，20 ℃、120 r/min 振荡洗脱15 h，充分解吸后，过滤并测定滤液中dA的浓度，按式(3)计算dA解吸率。

dA解吸率=ρ2/(ρ0-ρ1)

(3)

式中：ρ2为解吸液中dA的质量浓度，mg/L。

1.2.5 洗脱剂的选择

用原生物转化液2倍体积的洗脱液在20 ℃、120 r/min振荡洗脱吸附饱和的D101树脂5 h，收集洗脱液，检测各洗脱液中各组分浓度，计算dA、A、T的解吸率。

1.2.6 动态吸附与解吸

动态吸附：称取D101树脂20.0 g，湿法装柱，将适量生物转化液通过树脂柱，测残液中dA质量浓度，以dA吸附量为指标考察上样液的体积、体积流量等因素对树脂吸附性能的影响。

动态解吸：将0.1 mol/L Na2CO3水溶液以1.5 mL/min的体积流量通过已吸附饱和的树脂柱，每10 min检测洗脱液成分，待将大部分杂质洗脱掉且只有少量产物被洗掉时，改用30%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，考察洗脱剂用量对树脂解吸性能的影响。

2 结果与讨论

2.1 大孔吸附树脂的静态吸附-解吸结果

2.1.1 吸附树脂的筛选

由于dA在酸性环境下易水解，故在选用吸附树脂时不考虑阳离子树脂。不同吸附树脂的静态吸附与解吸结果见表1。可以看出，D101、AB-8 对dA均有较大的吸附率，但较之D101，AB-8的dA解吸率偏低，故由此确定D101为最适吸附树脂。D101为国产树脂，价廉易得，适于实验室及实际生产使用。

表1 不同吸附树脂的静态吸附与解吸结果

2.1.2 pH对静态吸附的影响

生物转化液的pH对各成分吸附的影响主要有：碱基及核苷在不同pH的生物转化液中呈现不同的形式；溶液pH的改变可以影响有效成分在溶液中的溶解度；溶液pH变化改变溶液极性, 影响成分和大孔吸附树脂分子间作用力[12]。树脂吸附15 h后，不同pH对dA静态吸附的影响结果见图2。可以看出，在pH 6～8，树脂对dA的吸附率随着pH的增大而升高，当pH为8.0时，吸附率最大，而后又稍降，因此确定吸附最佳pH为8.0。pH 8.0时，接近dA在水溶液中的等电点，此时dA完全处于游离态，在溶液中的溶解度最小，因此吸附到D101型大孔树脂上的量最多。

图1 pH对吸附效果的影响

2.1.3 洗脱剂对解吸效果的影响

根据发酵液中各成分的性质考察不同洗脱剂对解吸效果的影响，实验结果见表2。可以看出，体积分数30%乙醇洗脱时，对主要杂质A、T和产物dA都有最大的洗脱量，但不能将其分离。0.1 mol/L Na2CO3溶液洗脱时，对A、T均有较大的洗脱量，而对dA的洗脱量相对很小，此时两者之间的差距最大。确定的洗脱方案：先用0.1 mol/L Na2CO3溶液洗脱，除去碱基，再用30%的乙醇洗脱得到纯度较高的dA。

表2 不同洗脱液对解吸效果的影响

2.2 大孔吸附树脂的动态吸附结果

2.2.1 D101型大孔吸附树脂对dA的动态吸附曲线

由图2可以看出，当吸附时间达到45 min时，基本达到吸附平衡，平衡时间短，这与其吸附机理有关。较短的平衡时间为树脂的工业应用提供了理论基础。

图2 D101型大孔吸附树脂对dA的动态吸附曲线

2.2.2 上样液体积流量对吸附效果的影响

将等量的生物转化液以不同的体积流量通过D101型大孔吸附树脂柱，进行动态吸附，考察不同上样液体积流量对吸附效果的影响。由图3可知，随着上样体积流量的增大，树脂的吸附量降低，不利于吸附的进行，但上样速度太慢，会延长吸附所需时间。考虑到吸附效果和工作效率，选择上样体积流量为2.0 mL/min。

图3 上样体积流量对dA吸附的影响

2.2.3 洗脱剂用量的选择

先用0.1 mol/L Na2CO3溶液洗脱，除去大部分碱基A、T，再用30%的乙醇洗脱，洗脱液用量见表3。由表3可以看出，用4.5倍柱体积的0.1 mol/L Na2CO3溶液洗脱剂、3倍柱体积30%乙醇洗脱剂即可基本将碱基和dA从树脂上解吸下来，将洗脱液收集后用高效液相色谱法进行分析，得到经过大孔树脂分离纯化后，质量分数为78.7%的2′-脱氧腺苷，收率为93.9%。

表3 洗脱剂用量对解吸效果的影响

3 结 论

利用静态吸附法,考查了7种不同类型的树脂对2′-脱氧腺苷的吸附、解吸情况。结果表明，大孔吸附树脂D101对dA的吸附、解析能力最强。通过不同洗脱剂的解吸实验得到洗脱方案：先用0.1 mol/L Na2CO3水溶液洗去大量杂质碱基，再用体积分数30%乙醇洗脱。

通过动态吸附实验，确定了D101型大孔吸附树脂分离纯化2′-脱氧腺苷的最佳工艺条件：上样体积流量为2.0 mL/min，洗脱剂依次为4.5倍体积 0.1 mol/L的Na2CO3水溶液、3倍体积30%乙醇，体积流量1.5 mL/min，可得到dA 78.7% 的溶液，收率93.9%。

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Separationandpurificationof2′-deoxyadenosinebymacroporousadsorptionresin

WUMingjie,DUJie,CUILi

(SchoolofLightIndustryandChemicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

The technique of separation and purification of 2′-deoxyadenosine by macroporous adsorption resin was systematically investigated. The adsorption capacity of seven different kinds of resins were studied based on the static adsorption. The results showed that D101 resin was the optimal sorbent and the procedure of desorption were sequential filtration with 0.1 mol/L Na2CO3solution and 30% ethanol at pH 8.0. The optimum operating parameters were determined by dynamic adsorption as follows： sample flow rate of 2.0 mL/min, elution flow rate of 1.5 mL/min, eluting with 4.5 times column volume of 0.1 mol/L Na2CO3, 3 times column volume of 30% ethanol orderly. Under the condition, the content of 2-deoxyadenosine is as high as 78.7%, and the yield could reach to 93.9%.

deoxyadenosine; macroporous adsorption resin; purification

吴明杰,杜杰,崔励.大孔吸附树脂分离纯化2′-脱氧腺苷[J].大连工业大学学报,2017,36(6):432-435.

WU Mingjie, DU Jie, CUI Li. Separation and purification of 2′-deoxyadenosine by macroporous adsorption resin[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(6): 432-435.

2016-03-18.

吴明杰(1989-)，男，硕士研究生；通信作者：崔 励(1964-)，女，教授.

TQ464.6

A

1674-1404(2017)06-0432-04