翅果油树种子CO2超临界萃取物抗炎及神经保护活性初步研究

权洪峰，杨 婷，彭晓东

·论 著·

翅果油树种子CO2超临界萃取物抗炎及神经保护活性初步研究

权洪峰1，杨 婷2，彭晓东1

目的本研究对翅果油树(Elaeagnus mollis Diels) 种子CO2超临界萃取物(EMSC)进行成分分析,并初步筛选其抗炎及神经保护活性，旨在为其开发利用提供实验依据。方法采用CO2超临界萃取技术对翅果油树种子进行萃取，并通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)法检测主要化学成分，采用峰面积归一化法得出各组分的相对百分含量。以二甲苯致小鼠耳肿胀炎症模型和大鼠皮层神经元细胞氧糖剥夺损伤模型初步考察超临界萃取物(EMSC)抗炎及神经保护活性。结果翅果油树种子CO2超临界萃取出油率为35.6%，通过GC-MS鉴定了4种脂肪酸成分，分别为棕榈酸、亚油酸、油酸和硬脂酸。EMSC低、中和高剂量组小鼠耳肿胀度与空白对照组小鼠耳肿胀度比较差异均有统计学意义(P<0.05)；低、中和高剂量组小鼠耳肿胀的抑肿率分别为52.63%、65.27%和74.22%。EMSC在0.2～40 μg/mL的剂量下均有显著的神经保护活性，且在0.5～10 μg/mL剂量下细胞生存率均值可达80%以上。结论EMSC在二甲苯致小鼠耳肿胀模型中表现出较好的抗炎活性，在大鼠皮层神经元细胞氧糖剥夺模型中具有显著的神经保护活性。

翅果油树种子；CO2超临界萃取物；抗炎活性；神经保护作用

翅果油树(Elaeagnus mollis Diels)为胡颓子科(Elaeagnaceae)胡颓子属(Elaeagnus)灌木或落叶小乔木,法国植物分类学家Diels于1905 年根据在陕西省户县采集到的翅果油树模式标本而定名。翅果油树自然分布范围狭窄，主要分布于山西省乡宁、翼城等地的低山、丘陵区和陕西省秦岭北麓的户县，是中国特有的木本油料植物[1-6]。据文献报道，翅果油树种仁蛋白质含量达32.21%,由17种氨基酸组成,其中有7种人体必需氨基酸，并富含维生素类，具有抗氧化、抗衰老等作用，种仁出油率高达40%左右，其中油酸及亚油酸极为丰富，具有降血压、降血脂、防治动脉硬化等作用。然而上述药理作用以及作用机制研究未见详细报道，鉴于此，本论文利用CO2超临界萃取技术制备翅果油树种子萃取部位，对此部位进行化学成分分析，并采用二甲苯致小鼠耳肿胀炎症模型和大鼠皮层神经元细胞氧糖剥夺损伤模型初步考察其抗炎及神经保护活性，为该药进一步的研究开发及应用提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：翅果油树种子采自山西省临汾市乡宁县，经宁夏医科大学药学院赵云生教授鉴定为胡颓子科胡颓子属植物翅果油树(Elaeagnus mollis Diels)种子。吲哚美辛(山西云鹏制药有限公司)，二甲苯(分析纯，天津禹王科技有限公司)，正己烷(色谱纯，Fisher Chemicals)，DMEM培养基(Hyclone公司)，MTT(Bioswamp)，胎牛血清(Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(Bioswamp)，Neurobasal -A培养基(Gibco公司)，左旋多聚赖氨酸(Sigma公司)，羊抗兔FITC标记二抗(Bioswamp)。

1.2 仪器：TH32-100X3 型超临界CO2萃取装置(上海震樨机电科技发展有限公司)，GC-MS-QP201气相色谱-质谱联用仪(日本Shimadzu)，CO2恒温培养箱(Thermo公司)，酶标仪(Thermo公司)。

1.3 实验动物：雄性ICR小鼠，体重为18～22 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供[动物合格证号：SYXK(宁)2011-0001]。动物均在室温(22±2)℃、相对湿度50%～60%、自然光照的条件下饲养。

1.4 实验方法

1.4.1 CO2超临界萃取物的制备及样品的甲酯化处理[7]：取翅果油树种仁5 kg，粉碎后投入萃取釜中。萃取压力为300 Bar； 萃取温度为55 ℃。称取翅果油树种仁CO2超临界萃取物100 mg，置50 mL锥形瓶中，分别加入0.5 mol/L氢氧化钾甲醇溶液、15%三氟化硼甲醇溶液以及正己烷，每步反应均在60 ℃水浴中加热回流，冷却后，加饱和氯化钠溶液洗涤，摇匀，静置使分层，上层液经无水硫酸钠干燥。

1.4.2 GC-MS分析条件及成分分析：①GC条件：HP-5 MS弹性石英毛细管柱(30 μm×250 μm×0.25 μm)；载气为氦气；升温程序：从100 ℃开始，先以3 ℃/min升至280 ℃，保持20 min；载气流量1.50 mL/min；分流比为20∶1；进样量1 μl。②MS条件：EI源，接口温度220 ℃，离子源温度200 ℃，电子能量70 eV，质量扫描范围m/z 40～600 amu。总离子流图中的各峰通过MS检测后所得质谱数据经NIST 数据库匹配，通过面积归一化法计算各化合物的相对百分含量。

1.4.3 抗炎活性研究[8]：将小鼠随机分为空白对照组、阳性对照组(10 mg/kg，吲哚美辛)，EMSC低剂量组(50 mg/kg)、中剂量组(100 mg/kg)和高剂量组(200 mg/kg)。连续灌胃给药7 d，末次给药 1 h 后，于小鼠左耳均匀涂抹50 μl二甲苯致炎，右耳为空白对照。2 h 后处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，用直径 8 mm的打孔器分别在小鼠左右耳同一部位打下圆耳片，称重。

1.4.4 神经保护活性研究：取培养7 d的原代大脑皮层细胞，吸去神经元培养液，加入无糖 DMEM，置于含5% CO2、3% O2和92% N2的37 ℃培养箱内培养孵育1～6 h，而后用正常培养基复糖复氧24 h。氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)前24 h给药至复氧 (reoxygenation，R)24 h后停止给药。EMSC剂量为0.2、0.5、1.5、2.0、40 μg/mL。采用MTT法在490 nm 处测量各组吸光值，计算细胞存活率。

2 结果

2.1 GC-MS成分分析:采用CO2超临界萃取法提取翅果油树种子油，出油率为35.6%；样品经GC-MS对EMSC的化学成分进行分析，得到总离子流图(图1，目录后)。实验结果表明：EMSC主要成分为棕榈酸、亚油酸、油酸和硬脂酸，其中亚油酸和油酸占脂肪酸总量的90.47%，见表1。

表1 翅果油树种仁CO2超临界萃取物GC-MS分析结果

2.2 翅果油树种子CO2超临界萃取物抗炎活性:实验结果表明空白组小鼠耳部经二甲苯处理后，表现出明显的炎症反应。与空白对照组比较，EMSC低、中和高剂量组可显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀的程度；低、中和高剂量组的抑肿率分别为52.63%、65.27%和74.22%，见表2。

表2 EMSC对小鼠耳肿胀的影响结果

注：*与空白对照组给药后耳肿胀度比较，P<0.05。

2.3 翅果油树种子CO2超临界萃取物神经保护活性：见图2(目录后)，大鼠皮层神经元细胞经OGD损伤后，模型组神经元细胞存活率降低至(48.88±1.87)%。在0.2～40 μg/mL剂量下，EMSC对OGD损伤皮层神经元细胞均有保护作用。在0.2～10 μg/mL剂量范围内表现出较高的保护活性，细胞生存率分别为(85.91±5.11)%、(87.21±3.01)%、(84.77±2.75)%、(80.78±3.23)%。

3 讨论

3.1 超临界萃取技术在中药领域的应用:超临界萃取技术在中药领域的应用是近些年发展起来的一项新的研究方向，其在中药提取领域的优势日益受到研究者的青睐。近年来，国内外使用CO2超临界萃取技术提取挥发油和油脂等低极性的成分取得了良好效果。与传统香料提取方法(水蒸气蒸馏和溶剂萃取)相比，超临界萃取技术有着突出的优势：萃取温度较低(CO2萃取温度常为40～50 ℃)，可有效防止热不稳定的化学成分分解变性； CO2超临界萃取过程不使用有机溶剂，无有机溶剂残留，因此萃取产物无污染； CO2超临界萃取过程周期较短，一般1～2 h即可萃取完成；超临界CO2具有杀菌的功效，获得的提取物安全性较高[9]。

3.2 二甲苯致小鼠耳肿胀模型在筛选药物抗炎活性中的应用:对于药物的抗炎活性筛选而言，二甲苯致小鼠耳肿胀模型是常用、便捷的急性炎症模型[10]。耳肿胀涉及组胺、缓激肽、前列腺素等炎症介质。这些炎症介质是通过血管舒张和增加血管通透性引起肿胀的[11]。本实验结果表明，翅果油树种子油低、中和高剂量组能够消除炎症反应，推测可能是通过干扰炎症介质的产生从而发挥抗炎作用。其作用机制还待进一步研究。

3.3 氧糖剥夺模型在筛选药物神经保护活性中的应用:脑缺血常伴随神经元细胞的损伤和凋亡，神经细胞保护药的发现对脑缺血的治疗有十分重要的意义。离体实验模型因实验条件易于控制、耗费药量少、试验周期短等优势被广泛用于神经保护药物活性筛选。目前氧糖剥夺模型已被普遍用来评价药物对脑神经保护的治疗作用[12]。实验对EMSC进行活性筛选发现，其在0.2～40 μg/mL剂量下对OGD损伤皮层神经元细胞均有保护作用，在0.5～10 μg/mL剂量范围内表现出较高的保护活性。然而当剂量增加至40 μg/mL时，细胞生存率略有降低，原因可能是过高的药物浓度抑制了损伤神经元细胞的恢复或者过度刺激神经元细胞。体外细胞实验中药物的代谢途径和方式不同于机体，因此，其体内作用及作用机制仍需深入研究。

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2017-07-31责任编辑马兴忠

关于撰稿的要求

来稿应具先进性、科学性和逻辑性。来搞应做到数据可靠、论点明确、结构严谨、文字通顺。论著、实验研究、临床研究、调查研究等一般不少于6 000 字( 不包括图表和参考文献) ，经验交流不少于4 000 字，综述、讲座等不少于5 000 字，病例报告等一般不超过1 500 字( 包括图表和参考文献) 。

Preliminarystudyonanti-inflammatoryandneuroprotectiveactivityoftheSCF-CO2extractfromElaeagnusmollisseeds

QUANHongfeng1,YANGTing2,PENGXiaodong1.

1.CollegeofPharmacy,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China；2.PharmacyDepartment,TheThirdPeople'sHospitalofNingxia,750011,China

PENGXiaodong,Email:pxd-123@126.com

ObjectiveTo analyzed the chemical constituents of SCF-CO2extract from Elaeagnus mollis seeds (EMSC) by GC-MS.The anti-inflammatory and neuroprotective effect of EMSC were screened to provide experimental basis for its exploitation and utilization.MethodsThe seeds of Elaeagnus mollis were extracted by supercritical fluid CO2.The chemical profiles of extract were analyzed by gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS),and the relative percentage content of each composition were calculated by peak area normalization method. The anti-inflammatory effect of EMSC were observed by the inflammation model on mouse ear swelling induced by xylene,and the neuroprotective effects of which were investigated by MTT assay in oxygen-glucose deprivation induced cortical neurons injury model.ResultsThe yield of oil recipe of EMSC was 35.6%. Four fatty acid components were identified by GC-MS,which were palmitic acid,linoleic acid,oleic acid and stearic acid. The mouse ear edema in low,medium and high dose group of EMSC had significant difference compared with the blank control group (P<0.05). The swollen suppression rate for mouse?ear?edema in low,medium and high dose group were respectively 52.63%,65.27% and 74.22%. The EMSC at dose of 5～200 uM had significant protect effect in OGD-induced cortical neurons injury model compared with model group,and the cell viabilities were over 80% at dose of 10～80 μM.ConclusionThe EMSC show better anti-inflammatory activity on the inflammation model in mouse ear swelling induced by xylene,and which can protect cortical neurons injured by oxygen-glucose deprivation model.

SeedsofElaeagnusmollisDiels;SCF-CO2extract;Anti-inflammatoryactivity

R917

A

10.13621/j.1001-5949.2017.11.0980

1.宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004 2.宁夏第三人民医院药剂科，宁夏 银川 750011

权洪峰(1981-)，男，实验师，主要从事中药药理研究。

彭晓东,Email:pxd-123@126.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20171109.1543.028.html