抗乙酰胆碱3受体抗体与原发性干燥综合征相关性研究

王 莉，周少岚，朱 蓉

·论 著·

抗乙酰胆碱3受体抗体与原发性干燥综合征相关性研究

王 莉，周少岚，朱 蓉

目的探讨抗毒蕈碱3型乙酰胆碱受体抗体(a-M3R)在原发性干燥综合征(pSS)中的临床意义。方法通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测pSS组(42例)和疾病对照组(系统性红斑狼疮及类风湿关节炎患者18例)、健康对照组(20例)的抗M3R抗体阳性率；并将pSS组分为抗M3R抗体阳性组和阴性组，分析pSS组中抗M3R抗体阳性患者与阴性患者在临床及免疫学等指标间的差异与关系。结果抗M3R抗体在pSS患者中的阳性率为71.43%，疾病对照组的阳性率为16.67%，健康对照组的阳性率为15.00%，pSS患者阳性率高于疾病对照组和健康对照组(P<0.05)。pSS组抗M3R抗体阳性患者IgG、IgA、RF值及抗SSB抗体阳性例数较阴性患者明显增高。随着唇腺病理分级增高，抗M3R OD值随之升高。pSS抗M3R阳性患者血液系统受累较阴性患者明显升高。结论抗M3R抗体对pSS有一定的辅助诊断价值；抗M3R抗体阳性的pSS患者易合并血液系统病变，唇腺组织机构破坏较重。

原发性干燥综合征；抗乙酰胆碱3受体抗体；酶联免疫吸附法；唇腺

原发性干燥综合征(pSS)是一种以侵犯外分泌腺，尤其是唾液腺及泪腺为主的慢性自身免疫性疾病，表现为口、眼干燥，还可有皮疹、关节炎、胆囊炎、胰腺炎、肝脏病变、肾小管病变、肺间质纤维化、血液系统受累等腺体外表现[1-2]。pSS的发病机制目前仍不十分清楚[3]。最近研究发现这可能与pSS患者血清中可以找到抗乙酰胆碱3受体(M3受体)的自身抗体有关[4-5]。本研究旨在探讨抗毒蕈碱3型乙酰胆碱受体抗体在原发性干燥综合征中的临床意义，以及与脏器受累、唇腺病理分级的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2014年8-12月宁夏医科大学总医院门诊及住院治疗的42例干燥综合征患者为pSS组，均符合诊断标准[6]，在征得患者同意后，采集血液及唇腺活检标本。其中男性2例，女性40例，男∶女=1∶20，年龄27～72岁，平均年龄(47±11.81)岁，病程1个月～20年，平均42.86个月，均排除系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等风湿性疾病。选择同期健康志愿者20例为健康对照组，其中男性4例，女性16例，男∶女=1∶4，年龄23～60岁，平均(44±11.08)岁，肝肾功能检查均正常。选择其他结缔组织病组18例(系统性红斑狼疮9例，类风湿关节炎9例)为疾病对照组，其中男性5例，女性13例，男∶女=1∶2.6，年龄23～74岁，平均(46±13.2)岁，符合1982年美国风湿病学会(ARA)SLE诊断标准以及1987年美国风湿病学会(ARA)RA诊断标准[7]，排除继发性干燥综合征。3组性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法检测抗M3受体抗体:取外周静脉血静置30 min，以3 000转/min离心10 min，取上清血清，置于-70 ℃冰箱中储存。实验前将标准品振荡混匀，洗涤缓冲液(50×)稀释，96孔样品加样，标准品和空白孔做复孔，用标本稀释液1∶1稀释后加入50 μl于反应孔内，加入稀释好后的标准品50 μl，加入待测样品50 μl，立即加入50 μl生物素标记抗体，盖上膜板，振荡混匀，37 ℃温育1 h，甩去孔内液体，加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，然后用吸水纸拍干，再重复操作3次。每孔加入60 μl亲和链霉素-HRP，轻轻振荡混匀，在37 ℃的条件下温育30 min，甩去孔内液体，再次加满洗涤液，然后振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复操作3次。每孔加入底物A、B各50 μl，轻轻振荡混匀，在37 ℃条件下温育10 min，避免光照。于波长450 nm的酶标仪上读取各孔的OD值，以吸光度OD值为纵坐标(Y)，相应的M-ACHRM3标准品浓度为横坐标(X)，得到相应的曲线，根据OD值由标准曲线换算样品相应的浓度。

1.2.2 唇腺标本的采集：采用Daniels[8]推荐的方式，患者仰卧位，络合碘消毒下唇内侧黏膜部，予2%利多卡因黏膜下麻醉，铺巾，做一字形横切口，分离并切取下唇唇腺组织适量，缝合伤口。取出的唇腺组织即刻入10%中性福尔马林固定。脱蜡、染色、脱水、观片。将制备好的病理片置于OLYMPUS生物显微镜×40下观察唇腺组织中淋巴细胞浸润灶，进行病理分级[9]。

1.3 临床检查及检测指标：眼科相关检查:泪液流率、泪膜破碎时间、角膜染色评分、结膜染色评分[10]；血清学检查:抗核抗体(免疫荧光法)、抗SSA、抗SSB(免疫印迹法)、IgG等。

1.4 统计学方法：采用SPSS 17.5统计软件，计数资料比较采用卡方检验。

2 结果

2.1 3组抗M3R抗体阳性率比较：以健康对照组的抗M3R抗体OD值均数±标准差为阳性界定值，判断3组中抗M3R抗体阳性率，结果pSS M3R抗体阳性率高于其余两组(P<0.05),见表1。

表1 各组抗M3R抗体阳性率比较[n(%)]

注：*与pSS组比较，χ2=15.267，P<0.05；#与pSS组比较，χ2=17.328，P<0.05。

2.2 pSS患者抗M3R临床检查结果:pSS组抗M3R抗体阳性患者IgG、IgA较阴性患者明显升高，P<0.05；pSS组抗M3R抗体阳性患者抗SSB、RF阳性例数明显升高，P<0.05，其他均无统计学差异(P均>0.05)，见表2。

表2 pSS患者抗M3R抗体

2.3 光镜下唇腺病理组织观察结果：健康对照组的唇腺组织腺泡、导管饱满，组织间没有慢性炎症细胞浸润，见图1(目录后)；pSS组唇腺组织中可见腺泡结构的破坏，腺泡变性、萎缩甚至消失，浆细胞和淋巴细胞浸润，腺体导管扩张，导管上皮细胞增生、上皮细胞排列紊乱，导管周围可见大量淋巴细胞浸润，聚集成灶，见图2(目录后)。42例pSS患者4个级别唇腺病理分级间抗M3R抗体浓度比较，F=3.495，P<0.05，随着唇腺病理分级增高，抗M3R抗体浓度增高。

2.4 pSS患者抗M3R阳性与脏器受累：42例pSS抗M3R阳性患者血液系统受累较阴性患者明显升高(P<0.05)，而肺间质病变与肾小管酸中毒患者2组间差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 pSS患者抗M3R阳性与脏器受累

3 讨论

原发性干燥综合征的特点是大多数患者血清免疫球蛋白升高，存在多种自身抗体。在副交感神经节后纤维支配的效应器上的胆碱受体称为毒蕈碱型胆碱受体，简称M胆碱受体。根据分子克隆技术，将M胆碱受体家族分为5种亚型[9]，即M1、M2、M3、M4、M5， M3受体的分布在这5种亚型中最为广泛，主要分布于副交感神经节后纤维所支配的效应器。研究发现抗M3受体抗体能够识别并且激活M3受体，并且与之长期结合。这导致M3受体对乙酰胆碱的敏感性下降，还可以造成M3受体的进行性破坏，最后出现腺体分泌减少、膀胱逼尿肌收缩力减弱等一系列胆碱能神经功能异常的表现[11-12]。

本研究表明，健康对照组、疾病对照组的阳性率均明显低于SS组，说明抗M3R抗体在SS患者中有一定的特异性，对诊断SS有一定的意义。这与国外Bacman[13]等学者的研究结果是一致的。本研究发现，抗M3R抗体阳性患者的角膜染色评分高于抗体阴性患者，而阳性患者的Schirmer、BUT值低于阴性患者，说明抗M3R抗体阳性患者临床症状比较严重。ELISA法发现阳性组的IgG、RF值以及抗SSB阳性比例高于阴性组。虽然唇腺活检阳性率在抗M3R抗体阳性组和阴性组间无统计学意义，但是抗体阳性组淋巴细胞浸润较阴性组为重，提示抗M3R抗体阳性患者的唇腺浸润比阴性患者明显，病情更重。考虑这些可能是由于抗M3R抗体能竞争性地与位于唾液腺、泪腺腺泡细胞膜上的M3受体结合，占据M3受体的结合位点，导致M3受体对副交感神经的递质乙酰胆碱的敏感性降低，并造成M3受体的进行性破坏，M3受体降解，进而影响乙酰胆碱与M3受体而发挥增加外分泌腺分泌等的M样效应。抗M3R抗体阳性组血液系统受累较阴性组明显升高，肺间质病变、肾小管酸中毒等脏器受累较阴性组无明显升高。通过以上结果可以认为抗M3R抗体对评价原发性干燥综合征病情严重程度有一定意义。至于与其他脏器受累之间的相关性分析，还需进一步扩大研究对象及临床观察指标，并在干燥综合征患者中进行抗M3R抗体的动态观察。

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CorrelationstudyonAnti-muscarinic3acetylholinereceptorantibodyandprimarySjgren'ssyndrome

WANGLi,ZHOUShaolan,ZHURong.

DepartmentofRheumatism,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

ObjectiveTo investigate the anti-muscarinic 3 acetylholine receptor antibody (a-M3R) in primary Sjgren’s syndrome ( pSS) clinical significance,and the relationship with organ involvement and with labial gland pathology classification.MethodsThe anti M3R antibody was detected by ELISA in pSS group (42 cases) and control group (18 cases of systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis) and healthy volunteers (20 cases);and the pSS group was divided into Anti M3R antibody positive group and negative group,and analyzed the differences and relationship in clinical and immunological indexes.ResultsThe positive rate of anti M3R antibody in pSS patients was significantly higher than that in the disease control group and the healthy control group (71.43%,16.67% and 15%,P<0.05). In the pSS group,the number of IgG,IgA,RF and anti SSB antibodies in patients with positive anti M3R antibody was significantly higher than that in the negative patients. With the pathological grading of the labial glands increased,the anti M3ROD value increased. The blood system involvement in pSS positive M3R patients was significantly higher than that in the negative patients.ConclusionThe detection of serum anti M3R antibody has certain auxiliary diagnostic value for pSS. The patients with anti M3R antibody positive pSS are prone to complicated with hematological diseases;the patients with high concentration of anti M3R antibodies have severe labial gland destruction in pSS patients.

PrimarySjgren’ssyndrome;Anti-musearinie3acetylholineantibodies;EnzymeLinkedimmunosorbentassay;Lipglands

R 442.8

A

10.13621/j.1001-5949.2017.11.0971

宁夏医科大学总医院风湿免疫科，宁夏 银川 750004

王莉(1976-)，女，山西籍，硕士研究生，副主任医师，从事风湿免疫科临床工作。

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20171109.1542.018.html

2017-07-01责任编辑马兴忠