针刺对氯喹致非组胺依赖性瘙痒模型小鼠延髓5—羟色胺能神经元及5—羟色胺受体2B表达的影响

赵一丁+闫婵娟+孙丹+李文彬+闫小宁

摘要：目的 觀察针刺对非组胺依赖性瘙痒模型小鼠瘙痒行为、延髓5-羟色胺（5-HT）能神经元及5-HT受体2B（5-HTR2B）表达的影响，探讨针刺在对瘙痒调控过程中的作用机制。方法 采用颈背部皮下注射氯喹方法制作非组胺依赖性瘙痒模型。40只C57B/6J小鼠随机分为造模组（针刺组、非针刺组）、生理盐水组和空白对照组，每组10只。成模后，针刺组针刺双侧“血海”“曲池”及“合谷”，采用提插和捻转手法刺激，每日1次，共3次，非针刺组不予针刺，生理盐水组予颈背部注射生理盐水后不做处理，空白对照组不做处理。分别观察各组小鼠行为学变化，免疫荧光和Western blot检测延髓5-HT能神经元及5-HTR2B的表达。结果 造模组小鼠搔抓次数明显高于生理盐水组和空白对照组（P<0.05），针刺组搔抓次数少于非针刺组（P<0.05），5-HT能神经元在空白对照组和生理盐水组表达均不明显，造模组小鼠5-HT能神经元表达明显增加，针刺后5-HT能神经元表达减少，针刺组和非针刺组延髓5-HTR2B表达明显高于生理盐水组和空白对照组（P<0.01），针刺组5-HTR2B表达低于非针刺组（P<0.01）。结论 针刺对瘙痒模型小鼠搔抓行为具有抑制作用，其机制可能是通过下调延髓5-HT能神经元及5-HTR2B的表达发挥作用。

关键词：针刺；非组胺依赖性瘙痒；5-羟色胺能神经元；5-羟色胺受体2B；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.014

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）12-0056-04

Effects of Acupuncture on Expression of 5-HT Neurons in Medulla Oblongata and 5-HTR2B on Mice Models with Chloroquine-induced Pruritus ZHAO Yi-ding， YAN Chan-juan， SUN Dan， LI Wen-bin， YAN Xiao-ning （Shaanxi Provincial TCM Hospital， Xian 710003， China）

Abstract： Objective To explore the effects of acupuncture on pruritic behaviors， expression of 5-HT neurons in medulla oblongata and 5-HTR2B on mice with chloroquine-induced pruritus； To discuss the mechanism of action of acupuncture in chloroquine-induced pruritus. Methods A non-histamine-dependent pruritus model was prepared by subcutaneous injection of chloroquine into the back of the neck. Forty C57B/6J mice were randomly divided into model-acupuncture group， model-non-acupuncture group， normal saline group and blank control group， with 10 mice in each group. After modeling， acupuncture was given in Xuehai， Quchi and Hegu on both sides. The plug and twist way was used to stimulate， once a day， three times. Model-non-acupuncture group received no acupuncture. Normal saline group received the neck injection of saline in the back. Blank control group received no treatment. Behavioral changes were observed， and immunofluorescence technique and Western blot were used to test the expression of 5-HT neurons and 5-HTR2B in medulla oblongata neurons. Results The number of scratches in model-acupuncture group and model-non-acupuncture group was obviously more than normal saline group and blank control group （P<0.05）. The number of scratches in model-acupuncture group was lower than that of model-non-acupuncture group （P<0.05）. The expression of 5-HT in medulla oblongata neurons was unclear in both normal saline group and blank control group. The expression of 5-HT neurons in medulla oblongata significantly increased in model group， which decreased after acupuncture. The expression of 5-HTR2B of model group was significant higher than normal saline group and blank control group （P<0.01）. Compared with model-non-acupuncture group， the expression of 5-HTR2B in model-acupuncture group significant decreased （P<0.01）. Conclusion Acupuncture can significantly inhibitendprint

基金项目：陕西省自然科学基础研究计划（2015JQ8317）

scratching behaviors in mice induced by chloroquine， and the mechanism may be realized by decreasing the expression of 5-HT neurons and 5-HTR2B in medulla oblongata neurons.

Key words： acupuncture； non-histamine-dependent； 5-HT neurons； 5-HTR2B； mice

瘙痒的定义最早由德国医生Samuel Hafenreffer提出[1]，是一种可引发搔抓意愿和搔抓反射的特异性皮肤感觉，是特应性皮炎、银屑病、荨麻疹等多种皮肤疾病的常见表现，其产生机制主要包括组胺依赖性瘙痒和非组胺依赖性瘙痒，后者涉及复杂的信号传导通路、多种介质和受体，临床上缺乏有效的治疗手段。研究显示，针刺对瘙痒有不同程度的抑制作用[2]，但作用机制尚不清楚。本研究拟构建非组胺依赖性瘙痒小鼠模型，观察针刺穴位对模型小鼠脊髓5-羟色胺（5-HT）及5-HT受体2B（5-HTR2B）能神经元表达的影响，探讨针刺在对瘙痒调控过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康C57B/6J雄性小鼠40只，SPF级，6～8周龄，体质量20～25 g，西安交通大学医学部实验动物中心，动物许可证号SCXK2012-003。飼养于室温18～24 ℃，相对湿度50%～70%，12 h/12 h光照交替环境，自由摄食饮水。采用随机数字表将40只C57B/6J小鼠随机分为造模组（20只）、生理盐水组（10只）和空白对照组（10只）。

1.2 主要试剂与仪器

一抗5-HTR2B（26408-1-AP），美国Proteintech公司；β-actin（SC-47778），美国Santa Cruz Biotechnology公司；羊抗鼠二抗，美国PIERCE公司；羊抗兔二抗，美国PIERCE公司；兔IgG免疫组化试剂盒、抗荧光衰减封片剂、DAPI染色剂，武汉博士德生物工程有限公司；丙烯酰胺、双丙烯酰胺、SDS、TEMED、过硫酸铵、甘氨酸、溴酚盐、DTT、考马斯亮蓝R-250、Tween20，美国Amresco公司；OCT包埋剂，武汉赛维尔生物技术有限公司；NC膜、BCA kit、Supersignalwest pico，美国PIERCE公司；RIPA蛋白裂解液，上海邦奕生物科技有限公司；Cocktail蛋白酶抑制剂，德国Roch公司。冰冻切片机（德国LAIKA），超低温冰箱（日本SANYO），荧光显微镜（日本OLYMPUS），台式离心机（美国Benchmark），电热恒温培养箱（上海生工生物工程股份有限公司），蛋白垂直电泳槽（美国Biorad公司），蛋白湿转仪（美国Biorad公司），电泳仪（北京六一仪器厂），摄像机（日本SONY），华佗牌一次性0.25 mm×25 mm针灸针（苏州医疗用品厂有限公司）。

1.3 造模

实验前小鼠放入透明树脂盒内每日适应1 h，3 d后除空白对照组外全部小鼠颈背部（肩胛连线中点上方约5 mm处）皮肤刮毛，适应1 h后于模型组小鼠颈背部刮毛区皮内注射氯喹50 μg/50 μL，生理盐水组小鼠颈背部刮毛区注射生理盐水，各组注射后立即放入透明脂盒内，观察小鼠行为学变化。

1.4 干预

将成模小鼠按随机数字表分为针刺组和非针刺组，针刺组取双侧“血海”“曲池”及“合谷”，小鼠穴位定位及针刺深度均参照《实验针灸学》[3]，将毫针直刺双侧血海、曲池及合谷5 mm，采用提插和捻转手法刺激，留针时间为20 min，每日1次，共治疗3次，非针刺组造模后不做任何处理，生理盐水组颈背部刮毛区注射生理盐水后不做任何处理，空白对照组不做任何处理。

1.5 取材

针刺后各组小鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，固定在操作台上，迅速开胸，提拉胸骨柄，完全暴露小鼠心脏，使用6号静脉输液器插入左心室后，用血管钳固定好输液器进针处，并夹闭心脏，剪开右心耳，打开静脉输液器最快滴速注入生理盐水，观察小鼠肝脏及肠管，待肝脏由红色变为白色，肠管鼓胀，四肢及尾部僵直，迅速紧贴小鼠枕骨下用剪刀断头，剔除多余皮肤、肌肉组织，用弯钳剪去颅骨，将大脑沿腹侧剥出并置于冰面上，切除小脑后定位延髓上、下界，取延髓后切半，一半置于冻存管内放入液氮罐中冻存，后移入-80 ℃冰箱中保存，用于Western blot检测；另一半置于4%多聚甲醛固定液中固定，经30%蔗糖溶液脱水4 d，待组织沉底后在冰冻切片机中做水平切片，收集切片于防脱载玻片上，置于切片盒中4 ℃冰箱保存用于免疫荧光检测。

1.6 行为学观察

小鼠颈背部中央剃毛区皮下注射氯喹/生理盐水后，立即将小鼠放回透明树脂盒内，保持室内安静，和空白对照组小鼠同时由摄像机录像40 min，针刺组小鼠治疗后再行观察，实验结束后回放录像观察小鼠活动情况。行为学观察以搔抓次数作为评判方法：以小鼠后爪离开盒子底面并搔抓皮肤，到其后爪落地或舔舐其后爪为一次完整的搔抓动作，在此期间不管搔抓多少次，均记为1次[4]，由2名不参加实验的工作人员记录小鼠搔抓次数。

1.7 延髓5-羟色胺能神经元荧光表达测定

将制备的延髓组织用含0.3%TritonX-100的PBS洗1次，再用PBS洗3次，每次10 min，10%羊血清封闭液封闭30 min，之后甩干净封闭液，晾干；一抗用PBS稀释（1∶200），4 ℃过夜，弃去一抗，0.3%TritonX-100洗2次，PBS洗1次，每次10 min；二抗用PBS稀释，室温孵育30 min，0.3% TritonX-100洗2次，PBS洗1次，每次10 min；室温孵育30 min，0.3%TritonX-100洗2次，PBS洗1次，每次10 min，DAPI染色剂染色5 min，0.3%TritonX-100洗2次，PBS洗1次，每次10 min，最后加入抗荧光衰减封片剂，加盖玻片，于荧光显微镜进行观察。endprint

1.8 延髓5-羟色胺受体2B蛋白表达测定

采用Western blot方法。取出保存的延髓组织，称重后研钵中倒入液氮，研碎组织块后移入EP管中，加RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂Aprotinin，裂解后取上清液置于EP管内，冰上保存，将各样品蛋白液1∶50稀释，参照BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白测定，每个样品取相同质量蛋白，加5×loading buffer后沸水煮10 min使其变性；将制备好的10%凝胶板放入电泳槽内，倒入1×Running Buffer，用细枪头加样，确定加样顺序并计算加样量；将电泳槽与电源连接好，以90 V稳压状态电泳，当溴酚蓝进入分离胶时将电壓调整至100 V，待溴酚蓝电泳至分离胶底部停止电泳；按方向依次放好滤纸、胶、膜，直至整个夹板保持紧密，含5%脱脂奶粉的TBS封闭，室温封闭4 h；结合一抗，4 ℃过夜，5-HTR2B（1∶1000），室温漂洗3次，每次10 min；结合二抗，室温结合2 h，羊抗鼠二抗（1∶10 000）、羊抗兔二抗（1∶10 000），室温漂洗3次，每次10 min，最后1次用TBS漂洗以去除吐温；化学发光，于暗室中曝光操作，梯度曝光10～300 s。

1.9 统计学方法

采用SAS9.3统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。组间比较采用Student's t检验，多组间比较采用方差分析，所有统计检验均采用双侧检验。P<0.05表示差异统计学意义。

2 结果

2.1 针刺对模型小鼠搔抓次数的影响

造模组小鼠搔抓次数明显高于生理盐水组和空白对照组（P<0.01），针刺后对造模组小鼠搔抓行为有抑制作用，针刺组搔抓次数低于非针刺组（P<0.05）。结果见图1。

2.2 针刺对模型小鼠延髓5-羟色胺能神经元表达的影响

5-HT能神经元在空白对照组和生理盐水组表达均不明显，造模组小鼠5-HT能神经元表达明显增加，在小鼠延髓皮质呈团块状分布，针刺后显示同视野针刺组与非针刺组比较5-HT能神经元表达减少。结果见图2。

2.3 针刺对模型小鼠延髓5-羟色胺受体2B蛋白表达的影响

非针刺组延髓5-HTR2B蛋白表达明显高于生理盐水组和空白对照组（P<0.01），针刺组延髓5-HTR2B蛋白表达明显低于非针刺组（P<0.01）。结果见表1、图3。

图3 各组小鼠延髓HTR2B蛋白表达免疫印迹图

3 讨论

中医对瘙痒的认识，早在《灵枢·刺节真邪》便有“虚邪之中人也……搏于皮肤之间，其气外发，腠理开，毫毛摇，气往来行，则为痒”，说明风邪犯表，正气出与抗争，腠理开泄，风邪游走于毛腠之间，故痒；《金匮要略·水气病脉证并治》有“……风气相搏，风强则为隐疹，身体为痒，痒为泄风”，说明风与热相搏，风邪偏盛则伤及营分，故痒；朱丹溪认为“诸痒为虚，血不荣肌肤，所以痒也”；戴原礼认为“有脾虚身痒……”，说明瘙痒与血虚、脾虚有关[5]。现代中医所讲瘙痒由风、湿、热、虫、毒之邪气郁于皮肤腠理，使其气血不和，肤失濡养，郁而生微热所致，或由于血虚风燥阻于皮肤，肌肤失养，内生虚热而发。

瘙痒是许多皮肤疾病常见而棘手的临床表现，如特应性皮炎、荨麻疹、银屑病等，这些疾病引发的瘙痒类型通常为非组胺依赖性瘙痒，不伴随发热、红疹等，传统抗组胺治疗无效。这类瘙痒是由一类机械热敏感的有髓鞘C-纤维（mechanoheat-sensitive C fibers，CMHs）介导的，这类纤维传导速度较快，其神经末梢主要分布在表皮，可以被非组胺类致痒剂（如氯喹）所激活，CMHs将信号传导到脊髓背角的浅层和深层，然后沿脊髓丘脑束上行传导到丘脑[6]。瘙痒作为一种伤害性刺激对脊髓上中枢组成的下行调制系统有激活作用，其中延髓头端腹内侧核作为下行系统的重要组成部分参与多种神经递质对感觉的调控[7]，其中5-HT是一种重要的内源性致痒物质，通过与其特异性受体结合，可引起磷脂酶C及丝裂原活化蛋白激酶信号通路的活化，诱导背根神经节神经元内储存的Ca2+释放和细胞外Ca2+内流，增加神经细胞兴奋性，产生痒觉[8]。有研究报道，针刺可降低5-HT致痒大鼠血清IgE含量及5-HT2A受体数量[9]。

本研究通过建立非组胺依赖性瘙痒动物模型，以中枢神经系统5-HT能神经元为研究对象，以针刺“曲池”“血海”“合谷”为干预措施，初步探讨了针刺止痒的可能中枢机制。曲池、合谷属手阳明大肠经，乃多气多血之经，善于开泄，能疏泄蕴于肌肤之邪，达到开腠理、疏风清热止痒的作用；血海属足太阴脾经穴为血会，具有理血活血、散风除湿的作用，取“治风先治血、血行风自灭”之意。本研究结果从动物行为学观察、5-HT能神经元的荧光表达及5-HTR2B表达3个层次，共同说明针刺对瘙痒模型小鼠的搔抓行为具有抑制作用，并可下调模型小鼠延髓5-HT能神经元及5-HTR2B的表达，降低神经细胞兴奋性，从而抑制痒觉的产生，从机制上阐明针灸止痒的可能靶点，为针刺治疗瘙痒性皮肤病提供实验依据。

参考文献：

[1] STEINHOFF M， STANDER S， IKOMA A， et al. The neurobiology of itch[J]. Nat Rev Neurosci，2006，7（7）：535-547.

[2] 王媛，徐斌.针灸治疗皮肤瘙痒的研究进展[J].中国中医基础医学杂志，2014，20（3）：419-422.

[3] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2007：255.

[4] SHIMADA S G， LAMOTTEA R H. Behavioral differentiation between itch and pain in mouse[J]. Pain，2008，139（3）：681-687.

[5] 王玉玺，王松岩.瘙痒症的辨证论治[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2011，10（5）：332-334.

[6] TSUDA M. Spinal dorsal horn astrocytes：New players in chronic itch[J]. Allergol Int，2017，66（1）：31-35.

[7] TiLLU D V， GEBHART G F， SLUKA K A. Descending facilitatory pathways from the RVM initiate and maintain bilateral hyperalgesia after muscle insult[J]. Pain，2008，136（3）：331-339.

[8] MOLLANAZAR N K， SMITHPK， YOSIPOVITH G. Mediators of chronic pruritus in atopic dermatitis：getting the it chout？[J]. Clin Rev Allergy Immunol，2016，51（3）：263-292.

[9] 邵鹏.针刺对5-HT致痒大鼠IgE与5-HT2A受体的影响[J].实用中医内科杂志，2012，26（10）：16-18.

（收稿日期：2017-05-15）

（修回日期：2017-06-13；编辑：华强）endprint