分子标记技术及其在益生菌分类中的应用

罗 游,田霄飞,王 露,夏枫耿,吴振强*

(1.华南理工大学 生物科学与工程学院,广东 广州 510006;2.广州市微生物研究所,广东 广州 510663)

分子标记技术及其在益生菌分类中的应用

罗 游1,田霄飞1,王 露1,夏枫耿2,吴振强1*

(1.华南理工大学 生物科学与工程学院,广东 广州 510006;2.广州市微生物研究所,广东 广州 510663)

益生菌的准确分类鉴定是益生菌应用于功能食品、药品开发的前提。由于益生菌菌群结构的多样性和复杂性,传统方法如形态结构、培养特征试验和生理生化试验等对其组成的研究准确性低且耗时长。随着分子生物学技术的发展,现代分子标记技术的应用为益生菌分类研究提供了一个新的方向。该文对常用的分子标记技术进行了概括包括分子杂交标记、PCR分子扩增标记和新型分子标记。以益生菌菌群分类鉴定为例,分析分子标记技术的基本原理、特点和现状,为其进一步开发提供基础。

益生菌;分子标记;鉴定;分类

益生菌是一类对宿主有益的微生物,具有调节肠胃失调、增强肠道免疫功能、抑制过敏反应和保护心血管系统的功能[1],能够加强黏膜屏障、降低术后感染并发症和降低“三高”等作用[2]。最常用的益生菌是乳酸菌(如乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属)和酵母菌[3]。人体和动物体内存在多种菌群,菌群之间存在着非常复杂的关系。目前对益生菌作用的分子机制还不甚清楚[4],因此益生菌资源未能得到充分的开发利用。对不同益生菌菌株的筛选鉴定、生理生化特性研究以及应用安全性评估是近年来研究的重要组成部分。利用形态学、生理生化反应等特征对益生菌种类的鉴定存在操作繁杂、耗时长和准确度低等问题,而且无法对亲缘关系较近的种进行鉴定[5]。然而,脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)分子标记技术的快速发展给微生物分类鉴定带来了极大的便利。该技术能够以电泳谱带样式的不同的形式直接表现生物个体或种群间基因组中特异性DNA片段的差异。目前已有几十种基于DNA序列多态性的分子标记被开发和应用,主要分为三类:(1)以分子杂交为核心的分子标记,有限制性片段长度多态性标记和染色体原位杂交标记等;(2)以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)为核心的分子标记,有简单重复序列、随机扩增多态性DNA标记、扩展片段长度多态性标记和序列位点标记等;(3)新型的分子标记,有单核苷酸多态性标记和表达序列标签等。本文对这些技术应用在益生菌分类鉴定方面进行系统论述。

1 以分子杂交为基础的分子标记技术

1.1 限制性片段长度多态性标记

限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)即用不同的限制性内切酶在特定序列处切开DNA分子,产生限制性片段。先电泳分离DNA片段后,再经过Southern印迹技术把DNA片段转移到硝酸纤维膜上。使用放射性标记探针与膜上DNA片段进行杂交,放射自显影的DNA条带图谱展示了基因组的多态性。这项技术最初用于分离有性繁殖后代和构建其遗传图。RFLP分析中所使用的探针是随机克隆的,与被检测物具有一定同源性的cDNA片段或单拷贝或低拷贝基因组片段。RFLP遍布低拷贝编码序列,且非常稳定。RFLP可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的,也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变、倒位、缺失还是插入造成的。RFLP所产生的DNA指纹图谱较适用于细菌种间及种内株间的分型鉴定。单用一种限制性内切酶所产生RFLP的条带相似度较高,难以显示个体间的遗传信息差异。几种限制性内切酶共同使用时可提高RFLP谱带的分辨率,有效展示种内株间遗传信息的差异[6]。此技术被认为是DNA指纹图谱中有效的分型方法之一[7]。

益生菌的鉴定方法中,线粒体DNA与PCR相结合的RFLP分析法应用较多。这得益于mtDNA较小,适于进行限制性酶切分析。LOPES C A等[8]对从葡萄汁样品中挑选出37株酵母进行了mtDNA和RFLP分析,把这些菌株分为9类。同时对筛选的酵母菌株MM f9进行了葡萄酒发酵试验,通过RFLP分析和DNA多态性分析检测了发酵前、中、后期的酵母菌群主要是汉逊酵母、毕赤酵母和酿酒酵母,这为筛选及鉴定优良葡萄酒酵母提供了可行的方法。IBRAHIM K等[9]使用PCR和RFLP方法对布基纳法索四个地区的Rabilé(从高粱啤酒中获得的干酵母)进行酵母菌株的分离和鉴定,分离出20株酵母菌,根据表型特征检测出3个属分别是假丝酵母(40%)、酵母菌(35%)和红酵母(25%),并从酵母中分离鉴定出两种特异菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa),这表明Rabilé中土著酵母菌群的多样性。ECATERINA L[10]从Apold地区的酒精发酵中分离出569株酿酒酵母,通过PCR-ITSRFLP方法鉴定了6种酵母菌株(A87、A169、A296、A314、A132和A413),其中菌株A87、A169、A296和A314是酿酒酵母,菌株A132和A413是贝酵母,鉴定的菌株是繁育土著酿酒酵母菌的基础,以便获得本地区正宗口味的葡萄酒。

1.2 荧光原位杂交

荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)是一种出现于20世纪70年代末的非放射性分子遗传学实验技术。其根据碱基互补配对原则,以荧光标记的寡核苷酸探针与目标DNA接合,最后用荧光显微镜即可直接观察目标DNA所在的位置。杂交使用的探针一般使用放射性同位素标记,通过放射自显影显示杂交信号,杂交信号经酶联显色或荧光显色得以显示。FISH技术安全、快速、灵敏度高,探针能较长时间保存,能多色标记、简单直观,可用于中期染色体及间期细胞的分析,也可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本、穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。其缺点是不能达到100%杂交,特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降;分辨率低,只能检测已知位点,通量较小,一次最多只能检测5～8个位点。1989年首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞[11],20世纪90年代以后,FISH新的发展趋势是由单色向多色发展。首先,WARD D C等[12]用生物素和汞或氨基乙酰荧光素(acetyl fluorescein amino,AFA)标记探针建立了双色荧光原位杂交技术,NEDERLOF P M等[13]随后创建了多色荧光原位杂交技术,提出同时用3种荧光素探测3种以上靶位DNA序列,时至今日,已经发展出了用多种探针检测的多色FISH。荧光原位杂交技术因其安全、准确、方便、实用等优点得到了广泛的关注及应用。

目前荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridiza tion,FISH)已用于研究主要细菌群体的变化情况,LIKOTRAFITI E等[14]通过体外添加两种益生菌(长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fer mentum))和两种益生元(异麦芽低聚糖(isomalto-oligosaccharide,IMO)和短链低聚果糖(fructo-oligosaccharide,FOS))等,对老年人的粪便微生物进行了培养,研究了双歧杆菌(Bifidobacterium)和拟杆菌(Bacteroides)在肠道中的变化情况。FISH还被用于检测天然乳清培养物中特定的乳酸菌[15]、牛奶制品中的乳酸菌[16]和发酵食品中益生菌双歧杆菌定量分析[17]。

FISH能够使用荧光显微镜或流式细胞仪直接枚举环境样品或其他混合群体中的全细菌细胞。近年来,在肠道微生物学方面已经进行了大量的FISH研究,主要集中在优势细菌群体[18]。尽管FISH适用于优势细菌种类鉴定并且使用相对容易,但该技术的检测阈值限制了其在亚优势菌群鉴定中的应用。另外,荧光探针的设计也是该技术推广应用的限制性因素,广泛的探针列表对于多样性研究是很必要的。当有合适的探针时,只要混合群体中的细菌群体以106CFU/mL的水平存在,利用FISH技术就能准确检测到该菌[19]。

2 以PCR反应为基础的分子标记技术

随着聚合酶链反应(PCR)技术的发展,基于PCR的分子标记方法相继出现。特定的PCR引物,物种特异性引物组合,甚至菌株特异性PCR引物都在不断发展[20]。以PCR为基础的分子标记方法在不需要培养的条件下为细菌的识别和混合种群多样性的研究提供了一个简单快速的方法,为益生菌多样性的快速和可靠质量控制提供了有力的工具[19]。

2.1 随机扩增多态性DNA标记

随机扩增DNA多态性分析(random amplified polymorphic DNA,RAPD)又被称为任意引物PCR(arbitrary primed PCR,AP-PCR),是一种基于PCR的分子标记技术,其利用随机引物或短引物退火到多个靶序列并针对形成益生菌种间差异的DNA条带[21]。其理论依据是不同的基因组中与随意引物匹配的碱基序列的位点和数目可能不同,因而用一组人为设计的核苷酸作为引物,通过PCR随机扩增可产生物种特异性的DNA谱带。RAPD能够在基因组序列未知的情况下分析微生物DNA的多态性,因此可以使用通用引物对种群进行分型分析。生成的RAPD谱带由重复或独特的序列组成,这些序列取决于模板DNA和所用引物序列之间的同源性。RAPD技术可用来分析各种微生物种间、亚种间乃至株间的亲缘关系,另外,RAPD的PCR产物还能作为探针与Southern杂交技术结合,用于基因组或菌落杂交,能填补基因组的遗传图谱和物理图谱间的空缺。该方法的主要缺点是分析结果取决于反应条件,因此可能在两个不同的实验室内出现不同的结果,并且由于每个引物扩增了基因组中的几个离散基因座,因此不能区分杂合子和纯合子[22]。

很多研究小组已经证实RAPD技术在区分鉴别大多数乳酸杆菌[23]和双歧杆菌[24]的种间差异是可靠的。随着16S rRNA基因测序的发展,RAPD被认为是使用最广泛的食品相关的乳酸杆菌的分型技术,重RAPD(RAPD与多个随机引物)已成功地用于分类鉴别乳酸菌[25],并已被证明能准确区分戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)[26]。RAPD也被用于区分16S rDNA相似的菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)[27]。RAPD是产生具有不同特异性的分类群特异性标记物的有力工具,已被开发用于鉴定嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermophilic)和乳杆菌属(Lactobacillus)[28]。JASMINE K等[29]通过设计RAPD引物,从蔬菜和其他食品中分离并鉴定的37株细菌,很多其他研究也已表明利用RAPD-PCR技术成功对多种乳酸菌进行了分离鉴定,结果表明,该技术适用于初步分离鉴定和表征细菌。

2.2 简单重复序列分子标记

简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)又称为微卫星DNA(microsatellite DNA)或简单的串联重复序列(short tandem repeats,STR),是以1～6个核苷酸为单位多次串联的重复序列,重复次数10～20次不等。串联重复单元数量的变化主要是由于DNA复制过程中的链条滑移,其中允许通过重复切除或添加重复单元进行匹配。简单重复序列根据其两端的保守序列设计一对特异性引物,PCR扩增,再经聚丙烯酰胺凝胶电泳就可显示不同基因型个体在这个SSR位点的多态性[30]。

SCHULLER D等[31]从葡萄酒中分离出361株酵母菌,用mtDNA进行限制性酶切,6个微卫星引物进行PCR扩增。研究得出葡萄酒发酵过程中的优势菌株是酿酒酵母(Sac charomyces cerevisiae)和贝酵母(Saccharomyces bayanus)。LAITILA A等[32]对麦芽糖生产过程中分离的700株酵母菌株,运用SSR引物进行分析,鉴定出了25种子囊菌酵母和18种担子菌酵母。SSR是一种新兴技术,对于遗传多样性的检测,这些微卫星已经成为分子标记的可选序列。据此可以将遗传型不同的菌株快速挑选出来,以方便遗传型相同菌株的归类分析,并且可避免重复鉴定,减少生化和遗传鉴定工作量。

2.3 内部简单重复序列分子标记

1994年,ZIETKIEWICZ E等[33]建立内部简单重复序列分子标记方法(inter simple sequence repeats,ISSR),其是在微卫星分子标记基础上发展起来的。把人工合成的16～18个核苷酸重复序列作为引物,对SSR之间的DNA序列进行PCR扩增。较SSR、ISSR在引物设计上简单许多,该引物由重复的二、三、四或五核苷酸基序的核心序列组成,无需知道DNA序列就可用引物进行扩增,还比RFLP、RAPD、SSR提供的遗传信息更多。如今ISSR在遗传作图、遗传多样性、基因定位、进化和系统发育等方面被广泛使用。

GALLARDO G等[34]应用ISSR-PCR鉴定和区分干燥伊比利亚火腿中的酵母,并且能快速鉴别出汉逊酵母株。FABIO M等[35]应用ISSR-PCR对用于制作传统/典型意大利面包的19个酸面团中的乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)和酵母微生物群进行分析,鉴定结果表明最常见的乳酸菌是乳酸乳杆菌(约占总LAB分离株的28%)、植物乳杆菌(约16%)和干酪乳杆菌(约14%)。酵母菌群中假丝酵母(Candida humilis)、Kazachstania barnettii和 Kazachstania exigua被鉴定出来。

与SSR标记相比最大的差别可能就是ISSR引物可以在不同的物种间通用,而SSR标记具有较强的物种特异性。

2.4 扩增片段长度多态性分析

1993年,ZABEAU M等[36]建立了扩增片段长度多态性分析技术(amplified fragment length polymorphism,AFLP)。AFLP是RFLP和RAPD技术的结合,基本原理是通过PCR选择性地扩增整个DNA的内切酶片段,在聚丙烯酰胺凝胶上电泳,产生一组特异的DNA限制性片段的谱图[37]。

AFLP分析广泛应用于遗传图谱构建、基因定位、种质资源鉴定、分子系统和群体遗传学等方面。这种方法也被用于区分系统发育密切相关的菌株戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和假乳酸杆菌(Lactobacillus pseudoplantarum)[20],另外,该技术用于乳杆菌和双歧杆菌亚种的菌株特异性鉴定[38]。AFLP衍生的标记物已用于鉴定和表征不同来源的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)[39]。

AFLP是在RFLP、SSR和RAPD之后发展最快的DNA指纹技术,其结合了RFLP的可靠性和严格的PCR退火条件,有高度特异性,既克服了RFLP技术中Southern杂交的烦琐和耗时的缺点。与RAPD-PCR相比,其在基因组水平上具有更好的再现性、更高的分辨率和灵敏度,同时该方法能够用于鉴别亲缘关系较近种以及亚种[40]。

2.5 放大剪切序列多态性分子标记

1993年,在RAPD技术的基础上Paran建立了放大剪切序列多态性标记(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)。CAPS技术提供了一种利用映射RFLP标记物的DNA序列,以开发基于PCR的标记从而省去了繁琐的DNA印迹。CAPS技术阐明了单个碱基变化引起的限制性片段长度多态性,如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)、碱基的插入或缺失,从而修饰PCR扩增子中的限制性内切核酸酶的识别位点[41]。引物的合成设计是基于数据库中基因组的序列信息或cDNA序列以及克隆的RAPD条带序列。CAPS的PCR扩增产物通过限制酶剪切,产生与传统RFLP相同类型的数据。CAPS已成功应用于酿酒酵母菌株的遗传鉴定和鉴别,通过获得的遗传图谱分析和确定多态性程度、遗传多样性和菌株之间的联系[42]。CAPS分析是多功能的,可以与单链构象多态性、SCAR、AFLP或RAPD相结合,以增加发现DNA多态性的可能性。CARS标记具有使用的引物长、稳定高和试验的可重复性高等优点[43]。

3 新型分子标记技术

3.1 单核苷酸多态性

单核苷酸多态性(SNP)是当基因组(或其他共享序列)中的单个核苷酸A、T、C或G在生物物种或配对染色体的成员之间发生的DNA序列变异,主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性,由突变使得个体之间和群体之间产生了差异。SNP在基因组非编码区中更为普遍,在编码区内要么是非同义密码子导致氨基酸序列的变化,或是同义密码子不改变氨基酸序列。SNP遍布于整个人类基因组中,根据SNP在基因中的位置,可分为基因编码区、基因周边和基因间三类[44]。SNP具有数量多、分布广泛、检测快速和利于发展自动化筛选等优势,并且具有更高的遗传稳定性,尤其是处于编码区的SNP。

BARRANGOU R等[45]鉴别了2株动物双歧杆菌亚种(Bifidobacterium animalissubsp.)全序列中的47个SNPs,以便深入了解这一物种的潜在功能和进化多样性,依据这2株菌的SNPs大小及数量,这些菌株被区分为1 268至304 414代[46]。DOUILLARD F P等[47]在基因组和表型水平上鉴定了4种市面销售益生菌的菌株,从Vifit和Idoform益生菌产品分离的鼠李糖杆菌菌株(L.rhamnosus)的基因组中的SNP的鉴定表明可能存在突变的热点。

3.2 表达序列标签

表达序列标签(expressed sequence tags,EST)指分离部分cDNA,一般长度为300～500 bp。EST是一种快速、划算的基于转录组的基因发现方法,已成为识别生物体内编码区域的一种有效方法[48]。目前,用到的含有ESTs子数据库分别是美国国立生物技术信息中心(National Center For Biotechnology Information,NCBI)的GenBank、欧洲分子生物实验室的(EuropeanMolecular BiologyLaboratory,EMBL)和日本国家数据库(DnaDataBankofJapan,DDBJ)。

虽然比较基因组学可以帮助确定基因,并且有可能鉴定以前被忽视的基因和纠正酵母基因组中的错误,但酵母或高等真核生物中的启动子预测和转录起始仍然是困难。对于酿酒酵母(S.cerevisiae),现仅有有限数量的cDNA序列产生,其中3 000个表达序列标签和cDNA可通过GenBank获得。EST为真菌提供了有效的工具,用于进一步研究基因表达,包括作为转录实验中的探针[49]。

EST技术已应用在分离与鉴定新基因、基因的定位克隆、基因差异表达的研究、制备cDNA芯片和构建遗传学图谱等方面。EST技术所获得的基因组信息不全面像调控序列、内含子等在基因表达调控中起重要作用的信息没有体现出来,以及在高表达和中表达丰度基因的EST存在冗余性,测序成本增加。

随着知识和信息的不断发展完善,分子标记技术一直在改进,新的分子标记技术相继出现。在对益生菌分类研究时,应根据要所研究生物类群的遗传背景和解决的问题选择合适的分子标记技术。

4 展望

在益生菌的分类鉴定研究工作中,DNA分子标记技术可被广泛使用,但各种方法各有其优势和一定的缺陷。在鉴定一个新种时,需要应用多个指标或多种方法综合分析所得的结果才能获得正确结论。

基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学等学科的不断发展,为益生菌的系统研究提供了新的思路和方向,不再是简单的描述种群多样性或证明有机体是否存在,而是能够揭示微生物群落和益生菌菌株在活体生物中扮演的功能角色,同时阐明益生菌对活体生物的真实影响,在此基础上能更准确地评价和筛选具有特定功能的益生菌,为研究益生机制提供了可靠的手段和技术。随着分子生物学理论与技术进一步的发展完善,必将开发出分析速度更快、信息量更大、准确度更高、成本更低的分子标记技术,DNA分子标记技术在益生菌分类研究中必将具有更大的应用空间。

[1]BORJA S,SUSANA D,AITOR B M,et al.Probiotics,gut microbiota,and their influence on host health and disease[J].Mol Nutr Food Res,2017,61(1)：1-15.

[2]刘 齐,孙美玲,王鲁峰,等.益生菌的功能活性及其分子机理探究的研究进展[J].中国酿造,2014,33(1):14-19.

[3]RIAL D R.The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health[J].J Nutr,2000,130(2S)：396S-402S.

[4]黄东彦,朱剑锋,周海泳,等.益生菌群维持肠道健康分子机制的研究进展[J].湖南生态科学学报,2016,3(2):43-50.

[5]BAGHERIPOOR-FALLAH N,MORTAZAVIAN A,HOSSEINI H,et al.Comparison of molecular techniques with other methods for identification and enumeration of probiotics in fermented milk products[J].Crit Rev Food Sci Nutr,2015,55(3)：396-413.

[6]SIQUEIRA J F,SAKAMOTO M,ROSADO A S.Microbial community profiling using terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP)and denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)[J].Oral Biol Mol Techn Appl,2017：139-152.

[7]YOSHIDA Y,MIYATA T,MATSUMOTO M,et al.Correction：a novel quantitative hemolytic assay coupled with restriction fragment length polymorphisms analysis enabled early diagnosis of atypical hemolytic uremic syndrome and identified unique predisposing mutations in Japan[J].PloS One,2017,12(5)：e0178015.

[8]LOPES C A,RODRÍGUEZM E,QUEROLA,et al.Relationship between molecular and enological features of Patagonian wine yeasts：relevance in selection protocols[J].World J Microbiol Biotech,2006,22(8)：827-833.

[9]IBRAHIM K,MARIUS K S,ALY S,et al.Isolation and molecular identification of yeast strains from"Rabilé"a starter of local fermented drink[J].Afr J Biotechnol,2016,15(20)：823-829.

[10]ECATERINA L.Isolating wine yeasts that are specific to the Apold region and identifying them through RFLP genetic methods[J].Int Lett Natural Sci,2015,44：10-14.

[11]GIOVANNONI S J,DELONG E F,OLSEN G J,et al.Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identification of single microbial cells[J].J Bacteriol,1988,170(2)：720-726.

[12]WARD D C,LICHTER P,CREMER T,et al.Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization[P].2001.

[13]NEDERLOF P M,VAN D F S,WIEGANT J,et al.Multiple fluorescence in situ hybridization[J].Cytometry,1990,11(1)：126-131.

[14]LIKOTRAFITI E,TUOHY K M,GIBSON G R,et al.Anin vitrostudy of the effect of probiotics,prebiotics and synbiotics on the elderly faecal microbiota[J].Anaerobe,2014,27：50-55.

[15]BOTTARI B,SANTARELLI M,NEVIANI E,et al.Natural whey starter for Parmigiano Reggiano：culture-independent approach[J].J Appl Microbiol,2010,108(5)：1676-1684.

[16]MACHADO A,ALMEIDA C,ALMEIDA C,et al.Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for identification ofLactobacillusspp.in milk samples[J].Int J Food Microbiol,2013,162(1)：64-70.

[17]LAHTINEN S J,GUEIMONDE M,OUWEHAND A C,et al.Probiotic bacteria may become dormant during storage[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(3)：1662-1663.

[18]WELLING G W,WILDEBOERVELOO L,RAANGS G C,et al.Variations of bacterial populations in human faeces measured by FISH with group-specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes[J].Biosci Microb Food Health,2000,19：79-84.

[19]MCCARTNEY A L.Application of molecular biological methods for studyingprobioticsandthegutflora[J].Brit J Nutr,2002,88(S1)：29-37.[20]GIRAFFA G,NEVIANI E.Molecular identification and characterization of food-associated lactobacilli[J].Ital J Food Sci,2000,12(4)：403-423.

[21]FUJIMOTO J,MATSUKI T,SASAMOTO M,et al.Identification and quantification ofLactobacillus caseistrain Shirota in human feces with strain-specific primers derived from randomly amplified polymorphic DNA[J].Int J Food Microbiol,2008,188(1)：210-215.

[22]BARDAKCI F.Random amplified polymorphic DNA(RAPD)markers[J].Turkish J Biol,2001,90(2)：185-196.

[23]HERBEL S R,VAHJEN W,WIELER L H,et al.Timely approaches to identify probiotic species of the genusLactobacillus[J].Gut Pathogen,2013,5(1)：27-40.

[24]PÁL K,SZÉN O,KISS A,et al.Comparison and evaluation of molecular methods used for identification and discrimination of lactic acid bacteria[J].J Sci Food Agr,2012,92(9)：1931-1936.

[25]GOSIEWSKI T,CHMIELARCZYK A,STRUS M,et al.The application of genetics methods to differentiation of threeLactobacillusspecies of human origin[J].Ann Microbiol,2012,62(4)：1437-1445.

[26]CHARTERIS W P,KELLY P M,MORELLI L,et al.Selective detection,enumeration and identification of potentially probioticLactobacillus andBifidobacteriumspecies in mixed bacterial populations[J].Int J Food Microbiol,1997,35(1)：1-27.

[27]MOHKAM M,NEZAFAT N,BERENJIAN A,et al.Identification of Bacillusprobioticsisolated from soil rhizosphere using 16S rRNA,recA,rpoBgenesequencingandRAPD-PCR[J].Probiot Antimicrob Protein,2016,8(1)：8-18.

[28]KWON G H,LEE H A,PARK J Y,et al.Development of a RAPD-PCR method for identification ofBacillusspecies isolated from Cheonggukjang[J].Int J Food Microbiol,2009,129(3)：282-287.

[29]JASMINE K,SULHEE L,YOUNG-SEO P,et al.RAPD analysis of Leuconstoc mesenteroidesstrains associated with vegetables and food products from Korea[J].LWT-Food Sci Technol,2017,77：383-388.

[30]KRISHNAN J,ATHAR F,RANI T S,et al.Simple sequence repeats showing'length preference'have regulatory functions in humans[J].Gene,2017,https：//doi.org/10.1016/j.gene.2017.07.022.

[31]SCHULLER D,CASAL M.The genetic structure of fermentative vineyard-associatedSaccharomyces cerevisiaepopulations revealed by microsatellite analysis[J].Anton Leeuw,2007,91(2)：137-150.

[32]LAITILA A,WILHELMSON A,KOTAVIITA E,et al.Yeasts in an industrial malting ecosystem[J].J Ind Microbiol Biot,2006,33(11)：953-966.

[33]ZIETKIEWICZ E,RAFALSKI A,LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994(20)：176-183.

[34]GALLARDOG,RUIZ-MOYANOS,HERNANDEZA,etal.Application of ISSR-PCR for rapid strain typing ofDebaryomyces hanseniiisolated from dry-cured Iberian ham[J].Food Microbiol,2014,42：205-211.

[35]FABIOM,RAFFAELLADC,ANNALet al.The lactic acid bacteria and yeast microbiota of nineteen sourdoughs used for the manufacture of tradition/typical Italian breads：interactions between ingredients and microbialspeciesdiversity[J].Appl Environ Microbiol,2011,doi：10.1128/AEM.07721-11.

[36]ZABEAU M,VOS P.Selective restriction fragment amplification：a general method for DNA fingerprinting[P].European Patent Office,1993.

[37]VOS P,HOGERS R,BLEEKER M,et al.AFLP：a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acid Res,1995,23(21)：4407-4414.

[38]SISTO A,DE B P,VISCONTI A,et al.Development of a PCR assay for the strain-specific identification of probiotic strainLactobacillus paracasei IMPC2.1[J].Int J Food Microbiol,2009,136(1)：59-65.

[39]MARC V,SABRI M N,KATRIEN E,et al.Reclassification ofLactobacillus brevisstrains LMG 11494 and LMG 11984 asLactobacillus parabrevissp.nov.[J].Int J Syst Evol Microbiol,2006,56：1553-1557.[40]LI S W,WEI F C,DU J,et al.Genetic diversity and spread oflissorhoptrus oryzophilus(Coleoptera：Curculionidae)in China,based on amplified fragment length polymorphism[J].J Asia-Pacific Entomol,2017,20(3)：935-941.

[41]CHEŁKOWSKI J,STEPIEN′L.Molecular markers for leaf rust resistance genes in wheat[J].J Appl Genet,2001,42(2)：117-126.

[42]PÉREZ M A,GALLEGO F J,HIDALGO P.Evaluation of molecular techniques for the genetic characterization ofSaccharomyces cerevisiae strains[J].FEMS Microbiol Lett,2001,205(2)：375-378.

[43]TANAKA M,TAKAHATA Y,NAKAYAMA H,et al.Development of cleaved amplified polymorphic sequence(CAPS)-based markers for identification of sweetpotato cultivars[J].Sci Hortic,2010,123(4)：436-442.

[44]LEACHA D,OAKS J R.The utility of single nucleotide polymorphism(SNP)data in phylogenetics[J].Ann Rev Ecol Evol Syst,2017,48(1)：1-6.

[45]BARRANGOU R,BRICZINSKI E P,TRAEGER L L,et al.Comparison of the complete genome sequences ofBifidobacterium animalis subsp.lactisDSM10140andBl-04[J].J Bacteriol,2009,191(13)：4144-4151.

[46]LENSKI R E,WINKWORTH C L,RILEY M A.Rates of DNA sequence evolution in experimental populations ofEscherichia coliduring 20,000 generations[J].J Mol Evol,2003,56(4)：498-508.

[47]DOUILLARD F P,RIBBERA A,JÄRVINEN H M,et al.Comparative genomic and functional analysis ofLactobacillus caseiandLactobacillus rhamnosusstrains marketed as probiotics[J].Appl Environ Microbiol,2013,79(6)：1923-1933.

[48]HASHEMIPETROUDI S H,NEMATZADEH G.AHMADIAN G,et al.Expression analysis of salt stress related expressed sequence tags(ESTs)fromAeluropus littoralisby quantitative real-time PCR[J].Biosci Biotech Res Comm,2016,9(3)：445-456.

[49]ZHANG Z H,FRED S D.Mapping of transcription start sites inSaccharomyces cerevisiaeusing 5'SAGE[J].Nucleic Acids Res,2005,33(9)：2838-2851.

LUO You1,TIAN Xiaofei1,WANG Lu1,XIA Fenggeng2,WU Zhenqiang1*
(1.School of Biology and Biological Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China;2.Guangzhou Institute of Microbiology,Guangzhou 510663,China)

TS201.3

0254-5071(2017)11-0001-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.001

2017-07-19

广州市科技计划项目-产学研协同创新重大专项(201604046011)

罗 游(1992-),女,博士研究生,研究方向为发酵工程。

*通讯作者:刘功良(1980-),男,副教授,博士,研究方向为发酵工程。