动物用疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染检测

李桂梅,单 虎

(青岛农业大学动物科技学院,山东青岛 266109)

动物用疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染检测

李桂梅,单 虎

(青岛农业大学动物科技学院,山东青岛 266109)

为掌握动物用疫苗中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的污染情况,抽取16份市售动物用疫苗,分别采用ELISA和荧光定量RT-PCR检测病毒抗原和核酸.结果显示,ELISA检测中有2份(猪瘟疫苗)为阳性,荧光定量RT-PCR检测均为阴性.结果表明,我国兽用疫苗中的BVDV污染水平较低,但不容忽视.

疫苗;牛病毒性腹泻病毒;病毒污染检测;ELSA;荧光定量RT-PCR

牛病毒性腹泻病,又称牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea/Mucosal disease,BVD/MD),是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种以发热、腹泻、黏膜糜烂溃疡,以及怀孕母牛流产等繁殖障碍为主要特征的传染病,导致牛生产性能下降,严重危害牛养殖业健康发展[1].因此,许多国家都采取积极措施来控制BVD流行.BVDV属于黄病毒科(Flaviviridae),与猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和边界病毒(Border disease virus,BDV) 同为瘟病毒属成员.它们之间具有抗原相关性,在血清学上存在交叉反应[2]. 根据BVDV 病毒基因组5´-UTR序列的不同,BVDV可 分 为BVDV I型(BVDV-1) 和BVDV II型(BVDV-2)[3].

随着生物技术的迅猛发展,细胞培养在生命科学及生物制品研究中的作用起到越来越重要.BVDV作为牛血清中最常见的外源病毒污染物,会严重影响实验结果[4].在细胞培养过程中,如果使用了被BVDV 污染的犊牛血清,一方面会影响实验结果,另一方面,疫苗在制备过程中会受到污染,导致疫苗接种动物发病或死亡.对猪群进行猪瘟免疫接种是预防猪瘟的有效措施.目前猪瘟疫苗主要由猪瘟兔化弱毒株通过牛睾丸细胞增殖培养而制成.一旦供应睾丸细胞的牛只感染了BVDV,就会造成猪瘟疫苗的BVDV污染.猪群接种了受污染的疫苗,就会发生类似猪瘟的症状,导致接种猪发病或死亡.Wensvoort 等[5]最早报道了因接种污染BVDV的猪瘟疫苗而导致猪群感染的事件.除此之外,BVDV感染可对猪瘟疫苗的免疫效果产生重要影响:一方面可抑制猪瘟抗体产生,另一方面可刺激机体产生大量针对BVDV的抗体而使有效免疫原量减少,从而导致免疫失败[6].

为掌握我国动物用疫苗中的BVDV污染情况,本研究抽取16份市售动物用疫苗,分别进行ELISA和荧光定量RT-PCR检测.

1 材料与方法

1.1 疫苗

16份动物用疫苗均为市面所售,编号为1～16.其中,猪用疫苗5种,禽用疫苗4种.生产厂家编号为A～H.除H为国外企业外,其余均为国内动物疫苗生产企业.疫苗信息见表1.

表1 疫苗信息

1.2 试剂

牛病毒性腹泻病毒ELISA检测试剂盒(IDEXX BVDV Ag/Serum Plus Test):购自IDEXX公司(美国);QIAamp viral RNA 提取试剂盒以及QuantiTect probe RT-PCR:购自Qiagen(美国).

1.3 引物合成

参照已发表文献[7]设计引物及探针,交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表2).

1.4 ELISA

按照IDEXX试剂说明书要求进行.

1.5 荧光定量RT-PCR

使用QIAamp viral RNA提取试剂盒(Qiagen),按说明提取病毒RNA,并保存于-80 ℃,备用.使用一步法荧光定量RT-PCR,扩增病毒RNA.反应总体系25 µL,包括2 XRT-PCR Master mix(HotStarTaq DNA polymerase 和4 mmol/L MgCl2)12.5 µL、RT mix(Omniscript 和 Sensiscript reverse transcriptase)0.5 µL、上下游引物(20 µmol/L)各 0.5 µL、荧光探针(10 µmol/L)FAM(BVDV-1)和 TxR(BVDV-2)0.25 µL、RNA 模板 5 µL、灭菌双蒸水5.75 µL.使用罗氏LightCycler荧光定量PCR仪,进行荧光定量PCR仪扩增.反应程序如下:50 ℃反转录30 min,94 ℃预变性,以及灭活反转录酶15 min,94 ℃变性15 s,退火和延伸60 ℃ 1 min,设置40个循环.

表2 实验所用引物

2 结果

2.1 ELISA检测

对16份国内市场销售的动物用疫苗,用BVDV抗原ELISA检测方法进行检测.结果显示:检出2份BVDV阳性样品(8、10号),其余均为阴性;2份BVDV阳性样本均为细胞源猪瘟疫苗,分别来自于国内两个疫苗生产厂家(A、E).

2.2 荧光定量RT-PCR检测

所有样本中均未有检出BVDV核酸.

3 讨论

BVDV呈世界性分布,不仅可以感染牛,也可感染猪、绵羊、山羊、鹿和其他反刍动物,一旦暴发流行,很难被有效控制和消灭,会给各国畜牧业带来深远影响.此外,它能够污染生物制品,并可通过生物制品传播,造成巨大经济损失.因此,对用于生产疫苗的一些材料和制成品,必须进行严格BVDV检测,在排除BVDV污染后方可使用.对于BVDV检测,病毒分离是最准确的方法.但病毒分离耗时较长,结果获取比较慢.而ELISA方法以其快速、灵敏、简单并便于同时检测大量样品等优点而深受人们欢迎,成为最常规的检测方法,已被多个国家应用于BVDV检测[8].由于BVDV与CSFV在抗原上的相关性,ELISA方法也可能出现假阳性结果.本研究在ELISA检测的同时,进行了病毒核酸检测,最大限度保证了检测结果的准确性.

据报道,BVDV在我国牛群中的感染率很高.2010 年研究人员对30 个规模牛场进行了BVDV抗体抽检,发现阳性率高达80%以上[9].这表明BVDV在我国牛群中普遍存在.关于疫苗中的BVDV污染检测情况,国内也有报道.2012年叶兆美[10]对10 份猪瘟活疫苗样品和9 份蓝耳病活疫苗样品进行了BVDV核酸检测,证实有2份呈BVDV阳性,污染率为10.53%.范学政等[11]通过RT-PCR手段,检测了23个批次的猪瘟细胞苗,证实BVDV阳性率为21.74%. 本研究通过ELISA和RT-PCR手段,对16份市售动物疫苗中的BVDV污染情况进行了检测,发现有2份细胞源猪瘟疫苗呈BVDV抗原阳性,荧光定量RT-PCR核酸检测结果均为阴性.由于CSFV与BVDV在血清学存在交叉反应性,ELISA检出阳性可能是由于交叉反应引起的.

4 结论

本研究对16份市售商品化动物疫苗中BVDV污染情况进行了检测,发现有2份猪瘟疫苗呈现BVDV抗原阳性,核酸检测均为阴性.检测结果提示:我国动物疫苗中存在BVDV污染;对其污染的控制,不容忽视;各科研单位和疫苗生产企业应不断加强所用血清的BVDV污染检测,以保障我国生物制品安全.

[1] 朱礼倩,周艳君,于海,等. 牛病毒性腹泻在中国的流行现状分析[J]. 中国动物传染病学报,2011,19(5):83-86.

[2] TAO J,LIAO J,WANG Y,et al. Bovine viral diarrhea virus(BVDV)infections in pigs[J]. Veterinary microbiology,2013,165(3/4):185-189.

[3] RIDPATH J F,BOLIN S R,DUBOVI E J. Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes[J]. Virology,1994,205(1):66-74.

[4] 张志,张美晶,董雅琴,等. 猪用疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染的检测与分析[J]. 中国动物检疫,2015,32(11):76-79.

[5] WENSVOORT G,TERPSTRA C. Bovine viral diarrhea virus infections in piglets born to sows vaccinated against swine fever with a contaminated vaccines[J]. Research in veterinary science,1988,45(2):143-148.

[6] 毛晓娜,缪芬芳,季伟. 牛病毒性腹泻病毒在猪瘟疫苗中的污染情况及其检测方法的研究进展[J]. 中国畜牧兽医,2013,40(2):175-179.

[7] BAXI M,MCRAE D,BAXI S,et al. A one-step multiplex real-time RT-PCR for detection and typing of bovine viral diarrhea viruses[J].Veterinary microbiology,2006,116(1/2/3):37-44.

[8] 童钦,霍志云,胡桂学,等. 牛病毒性腹泻病毒检测方法的研究进展[J]. 中国农学通报,2012,28(14):79-83.

[9] 黄凯,张俊杰,刘英霞,等. 北京地区规模化牛场BVDV持续感染牛清除方案的初步实施[J]. 中国动物检疫,2010. 27(5):34-35.

[10] 叶兆美. 猪瘟和蓝耳病疫苗中BVDV和PCV污染情况调查[J]. 四川畜牧兽医,2012 (3):32-33.

[11] 范学政,宁宜宝,王琴,等. 用RT-PCR方法检测猪瘟细胞苗中污染牛病毒性腹泻病毒[J]. 中国兽医杂志,2010,46(1):8-10.

(责任编辑:朱迪国)

BVDV Contamination Detection in Animal Vacci nes

Li Guimei,Shan Hu
(College of Animal Science and Veterinary,Qingdao Agricultural University, Qingdao,Shandong 266109)

To investigate the contamination situation of Bovine virus diarrhea virus(BVDV)in animal vaccines,16 animal vaccines were collected. ELISA and fluorescence quantitative RT-PCR test were carried out to detect the virus antigen and nucleic acid,respectively. The results showed that 2 CSF vaccines were positive by ELISA and all samples were negative by fluorescence quantitative RT-PCR. The results showed that the BVDV contamination in animal vaccines in China was at a relatively low level,but it still could not be ignored.

vaccine;BVDV;virus contamination detection;ELISA;fluorescence quantitative RT-PCR

S851.34+7

B

1005-944X(2017)12-0078-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.12.022

国家重点研发计划(2016YFD0501100);中国-波兰科技合作委员会第36届例会项目(36-11)

单 虎