氮掺杂高量子产率荧光碳点的制备及其体外生物成像研究

姜 杰， 李士浩， 严一楠， 何丹农*

(1. 上海交通大学 材料科学与工程学院， 上海 200240；2. 纳米技术及应用国家工程研究中心， 上海 200241)

氮掺杂高量子产率荧光碳点的制备及其体外生物成像研究

姜 杰1,2， 李士浩1,2， 严一楠2， 何丹农1,2*

(1. 上海交通大学 材料科学与工程学院， 上海 200240；2. 纳米技术及应用国家工程研究中心， 上海 200241)

为获得高量子产率的碳点，以柠檬酸为碳源，苯二胺的3种同分异构体为氮源，采用两步溶剂热法制备了氮掺杂荧光碳点。利用透射电子显微镜(TEM)、紫外-可见吸收光谱 (UV-Vis)、荧光光谱、红外光谱 (FTIR)、X射线光电子能谱(XPS)对样品进行表征，并考察了碳点的细胞毒性和体外生物成像。实验结果表明：3种高量子产率碳点(Y=52%，60.4%，53.2%)的粒径均一，具有较好的分散性，平均尺寸分别为4.5，5.3，5.2 nm。碳点表面含有羟基、羧基、胺基等基团，在紫外光激发下均能发出明亮的蓝色荧光，并具有稳定的荧光性能。细胞实验表明：3种碳点具有较好的生物相容性，能够快速进入细胞并成功应用于细胞的荧光成像。

碳点； 高量子产率； 体外生物成像

1 引 言

近年来，碳纳米材料诸如碳纳米管、富勒烯、石墨烯等，因其独特的性质及在生物传感、成像等领域的潜在应用，受到广泛关注[1-2]。碳点(Carbon dots)作为一种新型的荧光碳材料，引起了科学界广泛的研究兴趣[3]。2004年，Xu等[4]在纯化由电弧放电法制备的单壁碳纳米管的过程中，首次分离出一种荧光碳纳米颗粒。2006年，Sun等[5]利用表面钝化，获得了荧光性能较好的碳纳米颗粒，并命名为“碳点”。碳点是粒径不超过10nm的近球形荧光颗粒，主要由碳、氢、氧、氮等元素组成。碳点不仅具有与半导体量子点相媲美的荧光性能，同时还具有生物相容性、低毒性、低成本、制备简单、易于功能化等独特优势，因此有望取代半导体量子点应用于细胞标记、生物成像、生物传感、催化、药物输送等领域[6-11]。

然而，与传统的量子点相比，碳点的荧光量子产率相对较低，限制了其作为荧光探针在生物成像等领域的应用[12-13]。目前，氮元素掺杂是提高碳点荧光量子产率的一种常用的方法。例如，Liu等[14]以柠檬酸为碳源，甘氨酸为氮源，制备了量子产率达到59.8%的氮掺杂碳点，与单纯以柠檬酸分子为原料制备的碳点相比(Y<10%)，经过氮掺杂后量子产率显著提高[15-16]。Yang等[17]以柠檬酸和乙二胺作为原料，同样合成了氮掺杂碳点，其荧光量子产率高达80%。因此，以柠檬酸为碳源，同时进行氮掺杂不失为一种提高碳点量子产率的方法。本文以柠檬酸为碳源，分别以苯二胺的3种同分异构体为氮源，两步溶剂热法成功制备了3种氮掺杂的具有高荧光量子产率且荧光性质稳定的蓝色荧光碳点。该方法制备的碳量子点具有较好的生物相容性，可应用于细胞荧光成像。

2 实验材料及方法

2.1主要原料

采用的主要原料有：柠檬酸，邻苯二胺，间苯二胺，对苯二胺，无水乙醇和硫酸奎宁，购自国药集团化学试剂北京有限公司，AR；二氯甲烷和甲醇，购自上海泰坦科技股份有限公司，AR；硅胶，购自上海泰坦科技股份有限公司，200-300目，AR。

2.2苯二胺-柠檬酸碳点的两步法制备

2.2.1苯二胺碳核的制备

将苯二胺的3种同分异构体(邻、间、对)分别溶于无水乙醇，将其加入到水热反应釜中，于180℃条件下反应6h，自然冷却至室温，得到3种不同的苯二胺碳核粗产物。以甲醇/二氯甲烷的混合溶液为洗脱剂进行柱层析提纯，旋蒸除去溶剂后分散于去离子水中，对应得到3种碳核C1、C2、C3。

2.2.2苯二胺-柠檬酸碳点的制备

将以上3种碳核溶液分别与柠檬酸水溶液混合均匀，180℃条件下反应6h，自然冷却至室温，即得到3种碳点粗产物。其他步骤与2.2.1相同。得到3种对应的苯二胺-柠檬酸碳点OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs。

2.3仪器和表征

透射电子显微镜(TEM，Jeol，2100F)用于表征碳点的大小和形貌，TEM样品制备是通过将一滴碳点溶液滴到超薄铜网上，室温下晾干。红外光谱(FTIR)是应用傅里叶转换红外光谱分析仪(FT-IR，Nicolet，170SX)，在650～2000cm-1的波数范围内得到的用于获得碳点的表面基团信息。X射线光电子能谱(XPS，Kratos，AXIS Ultra DLD)用于表征碳点元素构成。紫外分光光度计(UV-Vis，PerkinElmer，Lambda950)和荧光光谱仪(Hitachi，F-7000)用于表征碳点的光学性质。

2.4荧光量子产率的测定

将硫酸奎宁(Y=0.54)溶解在0.1mol/L的硫酸溶液中，并以其作为参比物，在同一激发波长下分别测定碳点稀溶液和参比物稀溶液的积分荧光强度以及对应该激发波长的吸光度(吸光度均小于0.05)。碳点量子产率的计算遵循以下公式：

(1)

其中，Y是量子产率，F是积分荧光强度，A是吸光度，n代表溶剂的折射率(二者均为1.33)。下标u表示样品，S则代表参比物。

2.5细胞毒性

采用CCK-8法检测材料对细胞的毒性。将NIH3T3细胞以每孔5×103个接种于96孔板中，置于细胞培养箱中(37℃,5% CO2)培养24h，然后加入不同浓度的碳点溶液，分别培养12，24，48h。接着，加入10% CCK-8溶液，继续培养2～4h。最后，用酶标仪(Bio-Rad,iMark/xMark)测定每孔细胞在450nm处的吸光度，记录并处理实验结果。

2.6细胞成像

利用激光共聚焦显微镜(Leica,TCS SP5)对碳点在细胞内的分布进行观察。样品制备：分别将NIH3T3细胞和Hela细胞以每孔5×103～1×104个接种于四分皿中，置于细胞培养箱中(37℃,5% CO2)培养12h，然后加入一定浓度的碳点溶液，继续培养2～4h，吸弃旧的溶液，PBS清洗3次。样品加入4%的多聚甲醛固定10min，PBS清洗3次，用PBS浸没四分皿后，在激光共聚焦显微镜下观察。

3 结果与讨论

3.1碳点的制备及表征

图1为3种高荧光量子产率碳点制备示意图。碳点由苯二胺和柠檬酸经过两步溶剂热反应合成：(1)在高温高压条件下，苯二胺的3种同分异构体分别经过水解、聚合及碳化作用，形成碳核；(2)柠檬酸在碳核的表面进一步聚合碳化，最终得到碳点。

图1 高量子产率碳点的合成示意图

图2 C1(a))、C2(b)和C3(c)以及OP-CCDs(d)、MP-CCDs(e)和PP-CCDs(f)的TEM图。

图2分别为碳核及碳点的TEM图片。碳核及碳点的粒径分布均匀，具有良好的分散性。经统计分析后发现，碳核C1、C2、C3的平均尺寸为2.0，2.3，2.2nm，碳点OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs的平均尺寸为4.5，5.3，5.2nm。显然，在加入柠檬酸经过二次碳化后，粒径明显增大，说明柠檬酸在碳核表面发生了聚合碳化。

图3 碳点的FTIR谱图(a)和XPS全谱图(b)

Fig.3FTIR spectra(a) and XPS spectra of carbon dots(b)

图4 OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs的C1s (a～c)、N1s (d～f)和O1s (g～i)分谱。

3.2高量子产率碳点的光学特性

OP-CCDs、MP-CCDs的乙醇溶液在可见光下为黄绿色溶液，而PP-CCDs为棕色，但3种碳点在365nm的紫外光激发下均能发出明亮的蓝色荧光，如图5(c)插图所示。图5(a)是OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs的紫外-可见吸收光谱，三者均在紫外光区有吸收，并且一直延续到可见光区。图5(b)是碳点的激发光谱，OP-CCDs的最强激发波长在362nm处，MP-CCDs在359nm，而PP-CCDs在356nm。图5(c)是碳点在365nm激发光下的发射光谱，它们的最强发射波长分别为425，435，438nm，说明在紫外光激发下的发射波长均位于蓝光区，与插图结果一致。通过计算，3种碳量子点在365nm激发下的量子产率分别为50.2%、54.3%和48.7%。

图6是OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs在不同的激发波长下的发射光谱。随着激发波长的增大，对应的发射波长向长波方向移动，且荧光强度呈现先升后降的趋势，表现出碳点典型的激发波长依赖性[25]。在生物成像应用中，根据这一特性，可以通过改变激发波长实现多色成像。OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs的最强发射波长分别为432，436，436nm，对应的激发波长为380，360，360nm，以硫酸奎宁作为参比物的荧光量子产率分别达到52%、60.4%和53.2%，与传统的荧光染料如硫酸奎宁(54%)以及包括ZnS(50%)、CdSe(40%～50%)在内的一些传统量子点的量子产率相当[26]。

图5碳点的紫外吸收光谱(a)、激发光谱(b)和在365nm激发下的发射光谱(c)。插图为碳点在可见光及紫外光下的图片。

Fig.5UV-Vis absorption spectra (a), excitation spectra (b) , and emission spectra excited by365nm (c). Inset shows the photograph of carbon dots under visible light and UV light.

图6 OP-CCDs (a)、 MP-CCDs (b)和PP-CCDs (c)在不同激发波长下的荧光发射光谱。

图7 碳点的光稳定性

图7是OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs在365nm激光持续照射下得到的光稳定性图。在经过48h的持续照射之后，荧光强度仍能够保持在80%、78%和75%，可见所制备的样品在具有较高量子产率的同时也具有超越一般半导体量子点的光学稳定性，这有利于碳点的长时间造影。

3.3碳点的体外生物成像研究

在碳点作为荧光探针用于生物成像前，常利用CCK实验检测碳点的细胞毒性。将不同浓度的碳点与正常组织细胞NIH3T3分别共孵育12，24，48h, 随着材料浓度的增加及共孵育时间的延长，细胞存活率整体呈下降趋势，但始终保持较高的生物相容性。在碳点浓度为40mg/mL的情况下，与NIH3T3细胞共孵育48h后, 细胞的存活率仍接近90%，说明所制备的碳点具有较低的细胞毒性，有利于细胞的生物成像应用(图8)。

图8 OP-CCDs (a)、MP-CCDs (b)、PP-CCDs (c)的细胞毒性评估。

图9 OP-CCDs(a)、MP-CCDs(b)、PP-CCDs (c)及PBS(d)与NIH3T3细胞共孵育6 h的荧光成像。

Fig.9Fluorescence imaging of OP-CCDs (a), MP-CCDs (b), PP-CCDs (c), and PBS(d) incubated with NIH3T3cells for6h, respectively.

图9(a)～(c)是OP-CCDs、MP-CCDs、PP-CCDs与正常组织细胞NIH3T3共孵育6h后的共聚焦图,(d)为空白对照组。在405nm的激发下，经3种碳点处理的细胞都呈现出明亮的蓝色荧光，且荧光信号在细胞质和细胞核中均有分布，主要集中于细胞质中;而在同样条件下，对照组中无荧光，说明碳点成功进入细胞并发出荧光。

4 结 论

本文以3种苯二胺和柠檬酸为原料，利用两步溶剂热法成功合成了3种高量子产率(Y>50%)的荧光碳点。所制备碳点的分散良好，平均粒径在5nm左右，表面含有丰富的基团，如羟基、羧基、氨基等。在紫外光激发下，3种碳点均能发出明亮的蓝色荧光，在经过48h的持续照射之后，3种碳点仍能保持75%以上的荧光强度，具有光学稳定性。同时，随着激发波长的增大，对应的发射光谱向长波方向移动，且荧光强度呈现先升后降的趋势，表现出激发波长依赖性。此外，3种碳点具有较好的生物相容性，并且能够被细胞被动吞噬，在405nm的激发下发出明亮的蓝色荧光，说明所制备的碳点可以作为荧光探针用于细胞成像。

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PreparationofN-dopedFluorescentCarbonDotswithHighQuantumYieldforIn-vitroBioimaging

JIANGJie1,2,LIShi-hao1,2,YANYi-nan2,HEDan-nong1,2*

(1.SchoolofMaterialsScienceandEngineering,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China;2.NationalEngineeringResearchCentreforNanotechnology,Shanghai200241,China)

In order to obtain carbon dots with high quantum yield, a simple two-step solvothermal method was used to prepare fluorescent N-doped carbon dots with citric acid as carbon source and three isomers of phenylenediamine as nitrogen source. The carbon dots were characterized by Transmission electron microscopy (TEM), ultraviolet-visible spectrophotometry (UV-Vis), fluorescence spectrophotometry, Fourier transform infrared spectra (FTIR), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), followed by studying the cytotoxicity andin-vitrobioimaging. The results show that three kinds of high quantum yield carbon dots (Y=52%,60.4% and53.2%) possessing uniform size and excellent dispersibility have been successfully prepared, and the average size is4.5,5.3,5.2nm. The prepared carbon dots with hydroxyl, carboxyl, amine and other groups on the surface can emit bright blue fluorescence under the excitation of ultraviolet light, holding favorable optical stability at the same time. In addition, the cell imaging experiments indicate that the three kinds of carbon dots have good biocompatibility, capable of rapidly entering cells and successfully applied to fluorescence imaging of cells.

carbon dots; high quantum yield;in-vitrobioimaging

2017-04-21；

2017-09-07

上海市浦江人才项目(15PJ1432200)； 国家重点研发计划(2016YFA0201204)； 上海市科学技术委员会项目(174419048000)； 上海市青年科技启明星项目(17QB1402900)资助

Supported by Pujiang Talent Project of Shanghai (15PJ1432200); National Key Research and Development Plan (2016YFA0201204); Project of Shanghai Municipal Science and Technology Committee (174419048000); Youth Science and Technology Star Project of Shanghai (17QB1402900)

1000-7032(2017)12-1567-08

O482.31

A

10.3788/fgxb20173812.1567

*CorrespondingAuthor,E-mail:hdn_nercn@163.com

姜杰(1993-)，男，上海人，硕士，2017年于上海交通大学获得硕士学位，主要从事碳量子点的制备及在肿瘤成像中的应用的研究。E-mail： 691150276@qq.com

何丹农(1956-)，男，上海人，教授，博士生导师，主要从事纳米材料与应用技术的研究。E-mail： hdn_nercn@163.com