高纯度大豆低聚肽制备及其醒酒机理的研究

雷海容，张枫燃

(1.长春大学 科技开发研究中心，长春 130022；2.吉林职业技术学院图书馆，吉林 龙井 133400)

高纯度大豆低聚肽制备及其醒酒机理的研究

雷海容1，张枫燃2

(1.长春大学 科技开发研究中心，长春 130022；2.吉林职业技术学院图书馆，吉林 龙井 133400)

利用风味蛋白酶水解大豆分离蛋白制备高纯度大豆低聚肽，分析其蛋白质含量、肽含量、相对分子质量分布和氨基酸组成等理化性质。结果表明：高纯度大豆低聚肽是极易溶于水的白色粉末，蛋白质含量为93.6%，相对分子质量分布≤1000的低聚肽成分含量占肽总量的87.15%，肽含量为91%，灰分为1.8%，水分为4.5%。高纯度大豆低聚肽的醒酒机理是抑制乙醇在体内的吸收，降低血液中乙醇浓度；同时具有良好的抗氧化活性，可有效增强清除超氧阴离子自由基及羟自由基能力，缓解乙醇代谢对人体的损害。

高纯度大豆低聚肽；风味蛋白酶；乙醇代谢；抗氧化活性；醒酒机理

中国制酒文化源远流长，渗透于整个中华五千年的文明史中，而且品种繁多，名酒荟萃。适量饮酒可以舒筋活血，对身体有益。然而，现代人相聚无酒不成席，经常过量饮酒，会损害大脑、心脏、肝、胃、脾等器官，重度酒精中毒可使呼吸、心跳受抑制而死亡。近年来，酒驾更是造成许多车祸的原因。

大豆肽是指大豆粕或大豆蛋白经酶解或微生物发酵，产生的相对分子质量在5000以下肽的粉末状物质[1]。高纯度大豆低聚肽是经过蛋白酶解、分离和精制得到的色泽纯白、无异味的白色粉末，其蛋白质含量≥90%，相对分子质量分布≤1000的低聚肽成分含量≥85%，肽纯度≥90%，溶解度=100%、灰分≤2.0%、NSI值=100%[2]。研究表明：大豆低聚肽具有抗疲劳[4]、提高机体免疫力[5]、降低人体血压[6]、降血清胆固醇[7]、促进脂质代谢[8]、调节血糖[9]、调节肠道[10]等多种生理功能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白(SPI)：通榆县益发合大豆制品有限公司。肽相对分子质量标准品(甘氨酸-酪氨酸相对分子质量为239.2，缬氨酸-酪氨酸-缬氨酸相对分子质量为379.5。蛋氨酸脑啡肽相对分子质量为573.23。亮氨酸脑啡肽相对分子质量为555.63～569.65。血管紧张素Ⅱ相对分子质量为1296)：美国Sigma公司。乙腈、三氟乙酸：色谱纯，美国Tedia公司。茚三酮溶液(20g茚三酮、苯酚2g用钾钠缓冲盐400mL和甲醇600mL溶解)：国产分析纯。CAD-40型大孔吸附树脂：郑州勤实科技有限公司。风味蛋白酶(食用级)：诺维信生物技术有限公司。粉末活性炭、硅藻土：国药集团化学试剂有限公司。其他试验均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

L-8800型氨基酸分析仪：日本日立公司。真空泵：海门市华丰真空设备有限公司。高效液相色谱仪：美国戴安Dionex Summit公司。实验室小型板框压滤机：上海信步科技有限公司；不锈钢微孔过滤器(φ100mm)：上海净密过滤设备有限公司；小型喷雾干燥机：山东天力；小型电渗析器(100mm×200mm)：苏州依斯倍环保装备科技有限公司。玻璃吸附柱(φ30mm×300mm)：北京满仓科技有限公司。DK-98-11A型电热恒温水浴锅(4孔)：天津市泰斯特仪器有限公司。FA2204B型电子天平：上海精密科学仪器有限公司。XL-1型马弗炉：上海精宏实验设备有限公司。电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高纯度大豆低聚肽的制备方法

目前，酶法是较常用的大豆肽的制备方法。其反应条件温和、反应时间短、效率高、不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，产品纯度及安全性高，无副作用[11]，产物易分离。风味蛋白酶水解SPI，可以脱除水解液的苦味[12]。因此，本文采用风味蛋白酶水解大豆分离蛋白制取高纯度大豆低聚肽。制备工艺按[3]所述方法。

1.3.1.1 工艺流程

大豆分离蛋白→溶解→水解→杀菌灭酶→酸沉→过滤分离→脱盐→提纯→浓缩→脱色、脱味→喷雾干燥→高纯度大豆低聚肽

1.3.1.2 具体操作要点

(1)溶解蛋白：将SPI按固液比1:20放入恒温水浴中搅拌，搅拌速度为40r/min，水温保持在55℃，搅拌50min。SPI的主要成分为7S和11S球蛋白，不易溶解。溶解蛋白时需要边投入边搅拌，同时热处理。搅拌50min时的溶解度比未经处理的SPI溶液提高1.5倍[13]。

(2)水解SPI：加入风味蛋白酶，加酶量为SPI重量的4%，水温仍保持55℃，继续搅拌4h。酶解温度和酶解时间是影响大豆低聚肽溶出率的重要因素。55℃为水解大豆低聚肽最佳温度[14]。为防止水解液变质，酶解时间以4h为宜。

(3)杀菌灭酶：将酶解后的蛋白液在90℃条件下进行加热搅拌30min，使酶失活，然后降温至40℃以下。风味蛋白酶最适温度不能超过60℃，当温度达到60～80℃时，酶活性被破坏，发生不可逆变性。因此，灭酶温度确定在90℃。

(4)酸沉：添加1O%的HCl调至大豆蛋白等电点pH4.2～pH4.5，在搅拌50r/min条件下使未酶解的大豆蛋白呈凝乳状析出。SPI在pH4.2～pH4.5之间全部沉淀，而大豆低聚肽却在此酸性条件下完全溶解。因此，可以把未酶解的SPI沉析出来。

(5)过滤分离：将经等电酸沉处理的混合液送入板框压滤机，压强为0.1MPa～1.0MPa，流速为1000L/h，助滤剂为硅藻土。使混合液经过滤分离所得的酶解大豆肽液均已达到透明水平为度，留滤液，弃滤饼。板框压滤机是固液分离的一种设备，除考虑去除酶解大豆肽液中残留的非水溶性的固形物外，还需选用硅藻土作为深层过滤助滤剂过滤大豆肽液混有的杂质沉淀、细菌及其它微生物。

(6)电渗析脱盐：电渗析装置的进料泵压强为0.2MPa，电流为18A～20A，溶液通过后，物料的电导率应在200μs/cm左右。由于蛋白水解物中含有一定数量的离子型杂质，这部分杂质会影响到产品的纯度和适用范围，需要对大豆肽液进行脱盐处理。

(7)树脂提纯：将预处理后充分溶胀的非极性CAD-40型吸附树脂采用常规湿法装柱，不得带入气泡，并且使树脂均匀填充。再将脱盐后的淡黄色液体送入树脂柱装置中，通过树脂柱的液相物为高纯度大豆低聚肽溶液。

(8)反渗透浓缩：将树脂吸附后流出的液体经φ≤10-10的反渗透膜，流出液为纯水，以大豆低聚肽为主要成分的溶液浓度约为10%。反渗透膜的膜孔径非常小，因此能够有效地去除溶液中的胶体、微生物等。同时施加一个超过渗透压的反压力时，大豆肽液被迫通过半透膜，无需化学品即可达到浓缩的目的。

(9)活性炭脱色、脱味：按溶液量的2%加入活性炭，搅拌30min，再将混有活性炭的溶液送入板框压滤机，在压强≤3.5Kg/cm2的条件循环过滤，至滤液呈无色，留滤液，弃滤饼。大豆蛋白酶解液通常呈现棕黄色或褐色，其中含有酚类物质以及多种色素分子[15]；另外，大豆肽液由于长时间加热，其中残留的糖类也可能发生焦糖化反应和美拉德反应，也可加深大豆肽液的颜色。由于活性炭的吸附性能，不仅可以脱色，还可以脱除大豆肽液中的异味。

1.3.2 高纯度大豆低聚肽样品的检测方法

大豆肽含量按GB/T 22492-2008检测；蛋白质含量分析采用凯氏定氮法按GB/T 5009.5-2003执行；水分含量按GB/T 5009.3-2003食品中水分的测定法-直接干燥法测定；灰分含量按GB/T 5009.4-2003执行；相对分子质量分布采用高效液相色谱仪分析，按《“大豆肽粉”国家标准》(GB/T 22492-2008)执行；氨基酸组成测定采用氨基酸分析仪进行测定，按《食品中氨基酸的测定国家标准》(GB/T5009.124-2003)执行。

2 结果与分析

2.1 外观与理化指标结果

高纯度大豆低聚肽色泽纯白，无苦、涩、腥、臭味，极易溶于水。蛋白质含量为93.6%，肽含量为91%，灰分为1.8%，水分为4.5%。

2.2 相对分子质量分布

分别用流动相制成不同相对分子质量肽标准品溶液，用孔径0.45μm聚四氟乙烯膜过滤后进样，得到系列标准肽的色谱图。以相对分子质量的对数(1gMv)对保留时间作标准曲线图和校正曲线方程。如图1所示。

作为化工园区一体化配套服务企业，上海化工区中法水务发展有限公司的智慧水务是园区生产性服务业的一大亮点。据公司副总经理邵伟介绍，智慧水务以独特的污水处理模式，全过程的污水水质监控，为企业提供量身定制的水处理服务。据介绍，目前公司运营着一个供水能力为20万t/d的工业水厂、一套供水能力为7000 t/d的生活水装置和一个供水能力为280 m3/h的脱盐水厂。同时还运营一个拥有多套生化处理装置，能够处理水质复杂的高浓度污水的污水处理厂，处理能力达到4.45万m3/d，为园区内用户提供全天候不间断的供水及污水处理服务。

图1 标准肽相对分子质量对数与色谱保留时间标准曲线

图2 低聚肽样品的高效凝胶渗透色谱图

对大豆低聚肽进行高效凝胶渗透色谱分析，图谱如图2所示。再用GPC数据处理软件计算得到不同肽段相对分子质量分布情况，如表1所示。

表1 大豆低聚肽样品的相对分子质量分布

由表1可知：大豆低聚肽样品组分的相对分子质量均小于2600，主要集中在128～1000之间，占肽总量的81.01%；相对分子质量小于1000的低聚肽占肽总量的87.15%，含量小于128的组分含有非大豆肽组成成分的氨基酸。

2.3 组分氨基酸含量

大豆低聚肽经定容、蒸发、超声溶解，通过0.45μm膜后的测定结果如表2所示。氨基酸总量为85.64g/100g，氨基酸组成合理且含量丰富,含有人体必需的8种氨基酸。

表2 氨基酸含量

3 高纯度大豆低聚肽的醒酒机理

3.1 酒精在人体内的吸收与代谢

酒精从口腔经胃进入肠，5min就可通过毛细血管壁进行扩散，迅速分布到人体各个部位，30min～60min时，血液中乙醇浓度就可达到最高点。吸收酒精量最大的是十二指肠，大约可以吸收80%，其次是胃，吸收量最少的是口腔[16]。另外，吸收酒精的速度除跟是否空腹、食物、胃壁情况及酒精含醇量等有关外，还存在较大的个体差异，酒精吸收速度在个体间相差2～3倍[17]，这种差异是遗传和环境因素综合作用的结果。

进入体内的酒精只有不足10%没有氧化分解而直接以原形经尿液、汗液及呼吸道排出体外，其余的都是经胃或肝脏中的酶系统进行代谢，将酒精氧化为乙醛。其中，90%以上酒精是在乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的催化作用下完成代谢的。另外，还有微粒体乙醇氧化系统(MEOS)及过氧化氢酶(CAT)清除自由基系统[18]。

酒精的代谢绝大部分是在肝脏处进行的，分别在肝细胞质液和肝微粒体中代谢。在肝细胞质液中代谢需要辅酶(NAD+)参与和乙醇脱氢酶的催化；在肝微粒体中进行代谢的称为微粒体乙醇氧化系统(MEOS)，需要细胞色素P450的存在和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的参与[19]。MEOS仅占肝内乙醇氧化量的20%，但长期饮酒及高浓度酒精则由MEOS氧化。生成的乙醛再由乙醛脱氢酶代谢为乙酸。这些乙酸除小部分在肝脏被利用外，大部分由肝脏输送到全身各部位，最后被分解为H2O和CO2，同时释放大量能量。乙醇代谢过程中会积累大量的自由基，如O2·-、·OH、H2O2及C2H50-等[19]。由于自由基最外层电子轨道上带有单个电子，所以极不稳定，易与其他原子基团结合形成稳定结构。这些过量的自由基刺激神经系统，导致自律神经平衡失调，引起血液中水分与电解质平衡失调[20]，表现为心跳加速、头晕目眩、局部皮肤过敏、肠胃不适等酒后症状。

3.2醉酒对人体的危害

被吸收的酒精积聚在血液和人体组织中，脑组织的酒精浓度是血液的10倍，血液中酒精浓度如超过300mg/100mL可导致昏迷或死亡。大量饮酒后还会引起血压下降，严重时会因呼吸中枢麻痹引发窒息而死。长期过量饮酒容易产生脂肪肝，心脏及其他肌肉功能衰退，也可能造成胃炎、胃溃疡及胰腺炎，甚至骨质疏松、高尿酸血症、低血糖症[17]。

3.3 高纯度大豆低聚肽的解酒防醉功效

3.3.1 抑制乙醇在人体血液中的吸收

乙醇通过减少从肌肉中释放丙氨酸来降低血液中丙氨酸浓度。所以，提高血液中丙氨酸浓度，可以使氨基及含碳物从肌肉转化到肝脏，补充足够的辅酶(NAD+)，加速将乙醇分解转化为乙酸，在人体正常的三羧酸循环过程中，被利用或分解后排出体外。亮氨酸比丙氨酸更具解酒功能，快速饮酒影响脑中的氨基酸平衡，而产生骨骼肌异常收缩反应。及时补充亮氨酸，可使脑中氨基酸组成恢复正常，改善骨骼肌异常收缩，并产生作为肌肉中转化为丙酮酸的氨基。此外，谷氨酸、脯氨酸和精氨酸也对酒精代谢有影响[21]。

高纯度大豆低聚肽具有快速被人体吸收的特性。动物口服摄入后，给药5min在血液中即可测出，10min达到血药峰值，半衰期为12h，表明高纯度大豆低聚肽不需要经过动物消化与酶解，摄入后通过消化吸收系统器官可直接快速进入血液[22]。并且食用剂量增大至人体正常摄入量的250倍时，未见临床症状与死亡现象，因此，确定高纯度大豆低聚肽无毒，具有食用安全性[9]。由于高纯度大豆低聚肽相对分子质量≤1000的成分含量占肽总量的87.15%(见表1)，主要成分是二肽及三肽[23]，所以，经代谢降解为组分氨基酸的周期要短于普通大豆蛋白与多聚肽，更利于人体吸收。服用低聚肽后降解生成的氨基酸可维持人体正常平衡，尤其是提高血液中亮氨酸与丙氨酸的浓度，辅酶(NAD+)得到足够补充，三羧酸循环活动维持正常，血液中乙醇浓度得到抑制。

3.3.2 有效增强清除自由基能力

·OH是毒性最大的自由基，由于活泼，所以破坏糖类、磷脂及有机酸等分子的速度极快。大豆低聚肽具有抑制·OH的能力[26]。O2·-是人体发生氧中毒的主要原因，主要表现在膜损伤、线粒体氧化磷酸化及其他变化。肝脏损伤就是O2·-过量引起的[20]。超氧化物歧化酶(SOD),可清除体内产生的过量O2·-，将其转化成H2O2和O2除去，使细胞免受损伤。通过灌服大豆低聚肽，可提高动物的肝脏组织中SOD的活力，证明大豆低聚肽具有良好的抗氧化活性[25]。肽的抗氧化活性与其氨基酸组成有关[27]，大豆低聚肽中的许多氨基酸具有抗氧化活性，如赖氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸等，以上几种氨基酸总量为32.36g/100g(见表2)。这是高纯度大豆低聚肽具有一定的抗氧化活性另一佐证。

因此，高纯度大豆低聚肽具有提高清除O2·-及·OH两种自由基的能力，可以减慢自由基反应，减轻酒后不适症状。

4 结论

利用风味蛋白酶水解SPI制备的高纯度大豆低聚肽，是极易溶于水的白色粉末，其蛋白质含量为93.6%，相对分子质量分布≤1000的低聚肽成分含量占肽总量的87.15%，肽含量为91%，灰分为1.8%，水分为4.5%。

根据乙醇在体内的代谢过程，利用高纯度大豆低聚肽富含氨基酸、吸收快的特点，可抑制乙醇在体内的吸收，降低血液中乙醇浓度，同时具有良好的抗氧化活性，可清除乙醇代谢过程中产生的过量O2·-及·OH自由基，可使人体组织免受氧化损伤。饮酒前服用高纯度大豆低聚肽可保护人体组织免受氧化损伤，缓解乙醇代谢带来的头痛、恶心及肠胃不适等酒后症状，起到醒酒的作用。摄入高纯度大豆低聚肽可望对乙醇代谢产生积极影响。

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责任编辑：程艳艳

ResearchonPreparationofHighlyPurifiedSoybeanOligopeptidesandItsAlcoholMetabolismMechanism

LEI Hairong1，ZHANG Fengran2

(1. Science and Technology Development Research Center, Changchun University，Changchun 130022, China; 2. Library, Jilin Vocational and Technical College, Longjing 133400, China)

Flavored proteinase is used to prepare highly purified soybean oligopeptides by hydrolysis of soybean protein isolate, and the physical and chemical properties of the protein content, peptide content, relative molecular mass distribution and amino acid composition are analyzed. The results show that the highly purified soybean oligopeptides, white powders with 93.6% protein, are easily soluble in water，the oligopeptide content of relative molecular mass distribution ≤ 1000 accounts for 87.15% of the total peptide, the peptide content is 91%, the ash content is 1.8%, and the moisture content is 4.5%. The alcohol metabolism mechanism of highly purified soybean oligopeptides is to inhibit the absorption of alcohol in organism and reduce ethanol concentration in blood. Highly purified soybean oligopeptides exhibits good antioxidant activities, which can effectively enhance the ability to remove superoxide anion radicals and hydroxyl radicals and reduce organism damage caused by alcohol metabolism.

highly purified soybean oligopeptide; flavor protease； alcohol metabolism; antioxidant activity；alcohol metabolism mechanism

2017-06-05

雷海容(1972-)，女，广西南宁人，工程师，硕士，主要从事食品加工与安全方面研究。

R15

A

1009-3907(2017)10-0022-06