PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路在结外NK/T细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

马 涛，邢宏运△，卞铁荣，李晓明，陈 燕，黄 娟

(1.西南医科大学附属医院血液内科，四川泸州 646000；2 西南医科大学中心实验室，四川泸州 646000；3.西南医科大学附属医院病理科，四川泸州 646000)

·论著·临床研究

PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路在结外NK/T细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

马 涛1，邢宏运1△，卞铁荣2，李晓明1，陈 燕1，黄 娟3

(1.西南医科大学附属医院血液内科，四川泸州 646000；2 西南医科大学中心实验室，四川泸州 646000；3.西南医科大学附属医院病理科，四川泸州 646000)

目的探讨PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路在鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤(ENKTCL-N)中的发病机制。方法通过免疫组织化学EnVision 法检测PTEN、p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR在51例ENKTCL-N及20例反应性增生淋巴结患者中的表达。收集患者临床资料，回顾性分析其临床特征、疗效及预后，采用Kaplan-Meier法进行生存分析。结果PTEN 在ENKTCL-N患者中的阳性率低于反应性增生淋巴结患者，p-AKT、p-4EBP1的阳性率高于反应性增生淋巴结患者，差异均有统计学意义(Plt;0.05)；p-mTOR 在ENKTCL-N患者中的阳性率高于反应性增生淋巴结患者，但差异无统计学意义(Pgt;0.05)。PTEN阳性患者生存率高于PTEN阴性者，差异有统计学意义(Plt;0.05)。结论PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路在ENKTCL-N中存在异常激活，可能与其发病机制相关；PTEN阳性患者预后可能较佳。

淋巴瘤，结外NK/T细胞，鼻型；mTOR信号通路；发病机制；预后

结外NK/T细胞淋巴瘤(extranodal NK/T cell lymphoma,nasal type，ENKTCL-N)的发病率低，主要累及鼻腔、扁桃体、上颚、皮肤等结外器官，在欧美国家少见，而亚洲及拉丁美洲多见，尤以日本、中国多见[1]。早期临床表现不典型，以坏死性病变为主，具有高度侵袭性，病程进展快，生存期短，预后较差。目前ENKTCL-N精确的发病机制尚不完全清楚，仍需要进一步研究，对其有效的治疗措施及预后的判断标准也在不断探讨之中。PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号传导通路是一种Ser/Thr蛋白激酶，广泛存在于恶性肿瘤中，控制着许多肿瘤相关的生物进程，如细胞生长、生存，蛋白质翻译，调控细胞周期及血管生成等，在胃癌、膀胱癌等多种肿瘤存在该通路的异常活化[2-3]。在淋巴瘤的研究表明，其与弥漫大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等淋巴瘤的发病密切相关[4-5]。但其与ENKTCL-N的发病关系尚不明确，本试验拟探讨PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路在ENKTCL-N中的发病机制及PTEN基因对ENKTCL-N预后的影响，旨在为ENKTCL-N的研究及判断ENKTCL-N的预后提供一定实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本 收集西南医科大学附属医院病理科2010年6月至2015年3月确诊的51例ENKTCL-N为观察组，其中男36例，女15例；年龄21～82岁，gt;60岁者14例，≤60岁者37例，平均年龄50.76岁；发生于鼻腔者29例，其他部位22例；按照Ann Arbor分期，其中Ⅰ期8例，Ⅱ期18例，Ⅲ期15例，Ⅳ期10例；无症状(A)者26例，出现无原因的发热超过38 ℃，连续3 d以上，盗汗，6个月内无原因的体质量下降10%等症状(B)者25例；乳酸脱氢酶(LDH)升高者21例(LDHgt;245 U/L)，LDH正常者30例；根据IPI评分将其分为0～2分组26例，3～5分组25例。另收集反应性增生淋巴结标本20例为对照组。

1.1.2主要试剂 兔抗人PTEN单克隆抗体、兔抗人p-4E-BP1单克隆抗体、兔抗人p-AKT单克隆抗体、兔抗人p-mTOR单克隆抗体购自Bioworld technology，Envision试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学法 PTEN、p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR采用免疫组织化学EnVision 法，用已知阳性组织作为阳性对照，已知阴性组织作为阴性对照，PBS代替一抗作为空白对照，免疫组织化学步骤按试剂说明书进行。

1.2.2结果判断 PTEN主要表达于细胞质，p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR主要表达于细胞核或细胞质，呈黄色或棕褐色表达，参照Fromowitz评分方法综合细胞质染色强度及阳性细胞数量进行半定量分析。染色强度判定:无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。每张切片在高倍镜下随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，阳性细胞百分率判定:lt;5%为0分,5%～25%为1分,gt;25%～50%为2分,gt;50%～75%为3分,gt;75%为4分;半定量综合得分：两项结果相加小于2分为阴性(-),2～3分为弱阳性(+),4～5分为中度阳性(++),6～7分为强阳性(+++)。

1.2.3随访 随访采用电话询问、患者住院病历资料查阅等方式，随访时间为4年。

1.3统计学处理 用SPSS19.0统计软件统计分析数据，计数资料采用率表示，比较采用χ2检验，采用Kaplan-Meier法进行生存分析，以Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PTEN、p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR在观察组及对照组中的免疫组织化学检测 PTEN、p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR的表达主要集中在细胞核或细胞质，呈棕黄色或棕褐色细颗粒状，在ENKTCL-N中着色比较均匀，而在反应性增生淋巴结中着色分散。p-AKT在ENKTCL-N及反应性增生淋巴结中的阳性率分别为82.35%及25.00%，差异有统计学意义(χ2=21.11，Plt;0.05)；p-4EBP1在ENKTCL-N及反应性增生淋巴结中的阳性率分别为84.31%及35.00%，差异有统计学意义(χ2=16.77，Plt;0.05)；p-mTOR在及反应性增生淋巴结中的阳性率分别为60.78%及40.00%,差异无统计学意义(χ2=2.5，Pgt;0.05)，PTEN在ENKTCL-N及反应性增生淋巴结中阳性率分别为39.21%及85.00%，差异有统计学意义(χ2=12.06，Plt;0.05)，见表1、图1～4。

表1 两组患者中PTEN、p-AKT、p-4EBP1及p-mTOR的表达情况

2.2观察组中PTEN的表达及与临床参数关系 PTEN的表达主要集中在细胞质，呈棕黄色或棕褐色细颗粒状，在ENKTCL-N中散在分布，在反应性增生淋巴结中分布均匀，见图5。PTEN在ENKTCL-N中的表达率为39.21%。PTEN的表达率与患者年龄、性别、分组、体能评分、结外侵犯个数、LDH及发病部位之间的差异无统计学意义(Pgt;0.05)；在Ⅰ+Ⅱ期组与Ⅲ+Ⅳ期组PTEN阳性率差异有统计学意义(χ2=7.60，Plt;0.05)，在IPI评分为0～2分组与3～5分组之间PTEN阳性率差异有统计学意义(χ2=4.76，Plt;0.05),见表2。

A：×200；B：×400

图1阴性对照的免疫组织化学表达

A：×200；B：×400

图2 p-AKT在ENKTCL-N中的免疫组织化学表达

A：×200；B：×400

图3 p-4EBP1在ENKTCL-N中的免疫组织化学表达

A：×200；B：×400

图4 p-mTOR在ENKTCL-N中的免疫组织化学表达

图5 PTEN的免疫组织化学表达

2.3PTEN阳性者与PTEN阴性者生存情况 使用Kaplan-Meier法做生存曲线(图6)，PTEN阴性及PTEN阳性ENKTCL-N患者1年生存率分别为70.8%、87.8%,2年生存率分别为47.5%、80.2%。PTEN阴性患者生存率较PTEN阳性患者低，PTEN阴性患者组中位生存时间为23个月，95%CI为17～28个月；PTEN阳性患者组中位生存时间为31个月，95%CI为28～34个月。PTEN阴性患者与PTEN阳性患者的生存时间行Log-Rank检验，差异有统计学意义(χ2=4.204，Plt;0.05)。

表2 PTEN与ENKTCL-N临床特征的关系

图6 ENKTCL-N中PTEN阳性与PTEN阴性患者生存曲线

3 讨 论

PI3K/Akt/mTOR信号传导通路广泛存在于细胞中，其调控着细胞周期进程蛋白质的翻译，在细胞生长、增殖、调控细胞周期进程及血管生成等多方面发挥重要作用。PTEN定位于10号染色体q23.3，是至今发现的第1个具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重活性的抑癌基因，是PI3K/AKT途径的负向调控因子[6]。PTEN可抑制mTOR信号通路，而mTOR信号通路下游效应分子P70S6K及4EBP-1启动后可促进蛋白质翻译。PTEN的主要生物学功能为抑制细胞迁移及局部的黏附、抑制细胞的增殖生长及诱导细胞凋亡，PTEN表达水平的降低、缺失及突变均可影响其功能[7-8]。

Xu等[4]对73例弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)进行研究，发现在DLBCL中可能存在PI3K/AKT/mTOR信号通路活化，p-AKT占54.8%,p-p70S6K占46.6%,p-4E-BP1占45.2%，存在mTOR信号通路激活的DLBCL患者病情进展快，疗效差。p-AKT在外周T细胞淋巴瘤中高表达，达49%，且提示着预后较差[9]。Witzig等[10]在Ⅱ期临床试验中利用mTOR信号通路抑制剂治疗35例套细胞淋巴瘤(MCL)，使用替西罗莫司每周250 mg，完全缓解率(CR)为3%，部分缓解率(PR)为35%，联合利妥昔单抗治疗缓解率达59%。Coiffier[11]在Ⅲ期临床试验中使用替西罗莫司每周175 mg，共3周治疗MCL，OR为22%、CR为2%、PR为20%。以上研究均证实mTOR信号通路在淋巴瘤中存在活化。

本研究采用免疫组织化学法检测PTEN、p-AKT、p-4EBP1、p-mTOR在ENKTCL-N及反应性增生淋巴结组织中的表达。结果显示：与对照组相比，ENKTCL-N患者p-AKT、p-4EBP1的表达率在观察组中明显增高，PTEN的表达率在观察组中则明显降低，差异有统计学意义；p-mTOR的表达率观察组的阳性率明显高于对照组，但差异无统计学意义(χ2=2.5，Pgt;0.05)，考虑可能与样本数量及实验室误差相关；综上结果，提示mTOR信号通路在ENKTCL-N中可能存在异常活化。

对患者临床资料及PTEN基因表达进行分析，发现PTEN的表达与患者年龄、性别、发生部位、临床分期、LDH水平无相关性，而PTEN阳性多为Ann Arbor分期Ⅰ+Ⅱ期及IPI评分为0～2分患者，与PTEN阴性患者相比，差异有统计学意义(Plt;0.05)。生存分析显示PTEN阳性患者生存率较PTEN阴性患者明显延长，差异有统计学意义(Plt;0.05)，提示PTEN阳性患者预后较佳。

高金莉等[12]采用相同研究方法，发现PTEN在ENKTCL-N中的阳性率为32%，在反应性增生淋巴结组织中的阳性率为86.7%，差异有统计学意义，与本研究的结论基本一致。但其统计患者临床资料发现PTEN的表达与患者年龄、性别、发生部位、临床分期、LDH水平均无相关性(Pgt;0.05)[12]，与本文的结果不完全一致，考虑原因为：PTEN的免疫组化检测是客观指标，但患者一般资料与实验人员所选取的观察组例数有密切关系，若进行更大的实验统计可能会得出更为准确的结果。

综上所述，本研究显示PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路在ENKTCL-N中存在异常激活，可能与其发病相关，可为靶向治疗结外NK/T细胞淋巴瘤提供新的靶点；PTEN阳性患者预后较佳，生存时间较长，PTEN阳性可能为ENKTCL-N预后良好因素。

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ExpressionandsignificanceofPTEN/PI3K/AKT/mTORsignalingpathwayinextranodalNK/Tcelllymphoma*

MaTao1,XingHongyun1△,BianTierong2,LiXiaoming1,ChenYan1,HuangJuan3

(1.DepartmentofHematology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.CenterLaboratoryofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;3.DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo investgate the pathogenesis of PTEN/PI3K/AKT/mTOR signaling pathways in nasal type extranodal NK/T cell lymphoma(ENKTCL-N).MethodsThe expression of PTEN,p-AKT,p-4EBP1 and p-mTOR in 51 patients with ENKTCL-N and 20 patients with reactive proliferative lymph nodes was detected by immunohistochemistry EnVision.The clinical data were collected and the clinical features,curative effect and prognosis were analyzed retrospectively.Survival analysis was performed by Kaplan-Meier method.ResultsThe positive rate of PTEN in ENKTCL-N patients was lower than that in patients with reactive hyperplastic lymph nodes,and the positive rates of p-AKT and p-4EBP1 were higher than those in patients with reactive hyperplastic lymph nodes,and the difference was statistically significant(Plt;0.05);The positive rate of p-mTOR in ENKTCL-N patients was higher than that in patients with reactive hyperplastic lymph nodes,but the difference was not statistically significant(Pgt;0.05).The survival rate of PTEN-positive patients was higher than that of PTEN-negative patients,and the difference was statistically significant(Plt;0.05).ConclusionPTEN/PI3K/AKT/mTOR signaling pathway is abnormally active in ENKTCL-N,which may be related to its pathogenesis;PTEN-positive patients may have better prognosis.

lymphoma,extranodal NK-T-cell;nasal type;mTOR signaling pathway;pathogenesis;prognosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.014

四川省卫生厅重点项目(110349)。

马涛(1990-)，医师，硕士，主要从事淋巴瘤、白血病诊治研究。△

，E-mail:xinghy52003@foxmail.com。

R551.2

A

1671-8348(2017)32-4514-03

2017-04-26

2017-06-19)