左甲状腺素联合多奈哌齐对成年期甲状腺功能减退症大鼠的影响及机制探讨

冯 佳,马昌义,张艳珍

(1.四川省宜宾市第二人民医院乳腺甲状腺科 644000；2.西南医科大学附属医院乳腺外科，四川泸州 646000)

·论著·基础研究

左甲状腺素联合多奈哌齐对成年期甲状腺功能减退症大鼠的影响及机制探讨

冯 佳1,马昌义1,张艳珍2

(1.四川省宜宾市第二人民医院乳腺甲状腺科 644000；2.西南医科大学附属医院乳腺外科，四川泸州 646000)

目的探讨左甲状腺素联合多奈哌齐对成年期甲状腺功能减退症大鼠的影响及可能机制。方法SD 雄性大鼠60只，按随机数字表分为A、B、C、D组，每组15只。其中B、C、D组大鼠均采取PLT制备甲状腺功能减退模型，A组作为正常对照。造模成功后C组和D组大鼠每日分别腹腔注射左甲状腺素(6 μg/100 g)，D组在C组的基础上给予在饮用水中加入0.005%多奈哌齐。2周后，采用Morris水迷宫观察大鼠学习记忆行为；用放射免疫法测定血清甲T3、T4 水平；采用免疫组织化学法和Western blot 法检测各组大鼠海马syntaxin-1 的表达情况。结果B组大鼠的逃避潜伏期和游泳路程明显延长，游泳速度明显变慢；C 组和D组的逃避潜伏期和游泳路程明显缩短，游泳速度明显增快；B组的T3、T4水平明显降低。C组和D组的T3、T4水平明显升高，其以D组升高最明显。免疫组织化学法和Western blot法结果显示B组大鼠海马内syntaxin-1 表达水平低于对照组，C 组和D组大鼠海马内syntaxin-1 表达水平明显升高。结论左甲状腺素联合多奈哌齐可改善成年期甲状腺功能减退症大鼠的学习和记忆能力，其机制与升高海马组织syntaxin-1的表达有关。

左旋甲状腺素；多奈哌齐；甲状腺功能减退；突触融合蛋白1；大鼠,Sprague-Dawley

甲状腺功能减退症(简称甲减)，是指由多种因素引起甲状腺激素合成、分泌或生物效应不足，表现为以甲状腺功能减退为特点的临床综合征[1]。甲状腺激素是三碘甲状腺原氨酸(triidothyronine,T3)和四碘甲状腺原氨酸(tetraiodothyronine,T4)的总称，是体内最大的内分泌腺甲状腺所分泌的激素，在体内以游离或者与血清蛋白的形式存在。在人或动物生长发育的各个阶段，都不能缺少甲状腺激素。该激素在维持新陈代谢及脑神经系统的的正常发育方面扮演着重要的角色，且与认知功能密切相关。既往研究证实，甲状腺激素缺乏能损害神经细胞，促进细胞凋亡，使神经系统发育明显滞后，临床以认知、行为、运动等脑的机能障碍为主要特征表现，显微镜下可见大脑及小脑的神经细胞数量减少[2]。突触融合蛋白1(syntaxin-1)是分布于神经细胞突触前膜上的蛋白，有文献指出甲减导致的的认知功能障碍可能与海马内的syntaxin-1水平失衡有一定相关性[3]。左甲状腺素替代治疗是对甲减患者的常规干预措施，然而对脑认知功能改善的程度的报道并不一致。大部分研究认为，常规剂量的左甲状腺素替代治疗并不能全恢复syntaxin-1水平[4]。一般大剂量的T4才能最大程度地恢复脑功能。值得注意的是，近年来，一种可治疗阿尔茨海默病的药物——多奈哌齐，受到众多学者的关注。有研究认为，甲减与阿尔茨海默病发病机制相似：均为脑内乙酰胆碱(Ach)水平下降，多奈哌齐通过增加突触间隙Ach水平，减轻甲减患者的认知损伤，或许可以用来作为甲减治疗的辅助药物。基于此，本研究以成年期甲减大鼠模型为研究对象，给予左甲状腺素和多奈哌齐联合治疗进行干预，同时以常规剂量作为对照，通过检测血清T3、T4水平及syntaxin-1在各组大鼠前额叶内的蛋白表达情况，探讨左甲状腺素联合多奈哌齐治疗是否可以恢复成年期甲减脑损伤及可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SD大鼠60只，体质量(245±30)g，购自上海市动物疫病预防控制中心。动物证号：SYXK(沪)2015-0013。

1.2主要仪器与试剂 病理切片机购自湖北泰康医疗设备有限公司；光学显微镜(蔡司LSM 510z)购自上海信裕生物科技有限公司；电子天平购自德国赛多利斯公司；放射免疫 γ 计数器(GC-300 型) 购自安徽中科中佳科学仪器有限公司；形态学图像分析软件(JD-801)购自江苏捷达科技发展有限公司。丙基硫氧嘧啶(PTU)购自上海博研生物科技有限公司；左旋甲状腺素(LT4)购自天津赫索制药有限公司；多奈哌齐片购自重庆植恩药业有限公司；4%多聚甲醛购自北京索莱宝科技有限公司；水合氯醛购自北京索莱宝科技有限公司；T3、T4 放射免疫试剂盒购自北京原子高科核技术应用股份有限公司；兔抗syntaxin-1蛋白多克隆抗体购自Sigma 公司；生物素标记兔抗小鼠lgG S-P 超敏试剂盒购自上海樊克生物科技有限公司；DAB 染色试剂盒购自北京赛驰生物科技有限公司。EPS-300 电泳仪、VE-186 转膜电槽购自北京原平皓生物技术有限公司。Morris 水迷宫系统购自上海欣软信息科技有限公司。

1.3方法

1.3.1模型制备及分组和干预方式 所有实验动物适应性喂养3 d后。把符合实验条件的SD大鼠按随机数字表分为4组，给予不同干预方式。正常对照组(A组)：常规喂养，灌服等体积的生理盐水。甲减组(B组)：每日腹腔注射丙硫氧嘧啶(PTU)1 mg/100 g，持续6周，建立成年期甲减大鼠模型。LT4替代组(C组)：4周后每日腹腔注射LT4(6 μg/100 g)2周；LT4联合多奈哌齐(D组)：4周后每日腹腔注射LT4(6 μg/100 g)，再继续喂养2周，同时在大黄每日饮用水中加入 0.005%多奈哌齐。

1.3.2行为学检测 药物干预 2周后对所有实验对象大鼠行 Morris 水迷宫行为学测试，考查大鼠认知及记忆能力。尽量保持室内光线一致，并保证迷宫附近物品及空间线索不改变。重点观察大鼠Morris 水迷宫逃避潜伏期、游泳路程、游泳速度的变化。

1.3.3标本制备

1.3.3.1血清制备 在进行行为学检测后，于次日晨9：00-11：00完成大鼠的采血工作。给予 7%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射，待麻醉显效后暴露胸腔，采集腹主动脉血 (每只1.5 mL)，高速离心后，取上清液存放于-20℃冰箱保存备测。

1.3.3.2脑标本制备 取血结束后将所有实验动物断头处死，迅速于冰上剥离脑组织，右脑置于 4%的多聚甲醛溶液中固定1周，行常规石蜡包埋，连续冠状切片，片厚6 μm，每只大鼠取5个包含前额叶的切片，置于4 ℃ 冰箱保存待做免疫组织化学检测。左脑分离出海马组织后存放于-80 ℃冰箱保存用于免疫印迹试验(Western blot)。

1.3.3.3放射免疫法测定血清甲T3、T4水平 T3、T4 水平的检测采用放射免疫法，测仪器为GC-300型放射免疫γ计数器，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。质控范围见表1。

1.3.4采用超敏SP 法行免疫组化检测 组织切片行SP法行免疫组化染色，以棕黄色为判定为阳性染色。在 200 倍视野下拍摄前额叶的各层(分子层、外颗粒层、外椎体细胞层、内颗粒层、内椎体细胞层)。再采用双盲法用生物图像分析系统进行定量分析，计算平均吸光度值(A)。

表1 T3和T4质控范围(mmol/L)

1.3.5Western blot 采集大鼠海马背侧组织置于匀浆器中，加裂解液冰上匀浆，离心，提取突触小体后，以BCA 法行蛋白定量分析。蛋白变性、电泳、转膜(电流为300 mA，转膜时间为60 min)，封闭。接下来用抗syntaxin-1 多克隆抗体，1∶2 500室温孵育2 h。立即加入浓度为1∶160 000的兔抗山羊IgG室温孵育1.5 h，弃二抗，PBS洗膜，在 X 线片暗盒内曝光，再用显影液显影。通过syntaxin-1 与内参GAPDH的条带A值的比值来代表目标蛋白的水平。

2 结 果

2.1观察大鼠Morris 水迷宫逃避潜伏期、游泳路程、游泳速度的变化 与A组相比，B组大鼠的逃避潜伏期和游泳路程明显延长(Plt;0.05)，游泳速度明显变慢(Plt;0.05)；与B组相比，C、D组的逃避潜伏期和游泳路程明显缩短，游泳速度明显增快(Plt;0.05)，C、D两组间比较无明显差异，与A组相比差异也无统计学意义，见表2。

表2 大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期、游泳路程、游泳速度变化

a：Plt;0.05，与A组比较；b：Plt;0.05，与B组比较

2.2观察大鼠血清T3、T4 水平的变化 与A组相比，B组的T3、T4水平明显降低，差异有统计学意义(Plt;0.05)。与B组相比，C、D组的T3、T4水平明显升高(Plt;0.05)，D组比C组升高更加明显(Plt;0.05)，见表3。

表3 大鼠血清T3、T4 水平浓度的变化

a：Plt;0.05，与A组比较；b：Plt;0.05，与B组比较；c：Plt;0.05，与C组比较

2.3免疫组化检测 syntaxin-1广泛分布于前额叶皮质各层的神经细胞膜，见图1。A组：Ⅰ层可见棕褐色颗粒密集和Ⅱ层均可见棕黄色颗粒状致密排列；Ⅲ层分为深、浅两层，呈疏松排列的棕褐色锥体细胞及少量星形细胞；Ⅳ层可见大量排列紧密的棕褐色色星形细胞和微量锥体细胞；Ⅴ层大量棕黄色大锥体细胞和少量小星形细胞组成。B组：细胞的排列和分布于A组相似相似，但密度比A组小。对A组和B组大鼠额叶syntaxin-1的表达情况进行量化分析后发现：与A组比较，B组大鼠前额叶皮质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ层syntaxin-1免疫反应产物A值显著降低(Plt;0.05)，见表4。syntaxin-1免疫反应产物在各组大鼠前额叶皮质Ⅲ层的表达见图2，syntsxin-1在各自大鼠前额叶各层的A值比较见表5。

2.4Western blot 法检测各组大鼠海马syntaxin-1表达变化 A、B、C、D组大鼠海马内syntaxin-1表达水平分别为0.527±0.098、0.267±0.085、0.578±0.092、0.628±0.087。B组syntaxin-1水平低于对照组，差异有统计学意义(Plt;0.05);C、D组syntaxin-1水平比B组明显升高(Plt;0.05)，与A组比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)。D组syntaxin-1水平比C组高，但差异无统计学意义(Plt;0.05)。见图3。

表4 A、B组大鼠前额叶皮质内syntaxin-1的A值比较

a：Plt;0.05，与A组比较

图1 syntsxin-1在A组和B组大鼠前额叶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ层的表达情况的典型图片(SP×200)

图2 syntaxin-1免疫反应产物在各组大鼠前额叶皮质Ⅲ层的表达(SP×200)

组别Ⅰ层Ⅱ层Ⅲ层Ⅳ层Ⅴ层A组13.35±1.1711.23±0.8710.24±0.7810.89±0.7811.76±0.86B组8.68±0.57a7.57±0.39a7.57±0.67a6.87±0.36a7.24±0.54aC组10.95±0.89b10.71±0.87b9.34±1.18b9.37±0.59b9.89±1.22bD组11.87±1.76b11.12±0.83b9.89±1.09b10.37±0.64b10.89±0.79b

a：Plt;0.05，与A组比较；b：Plt;0.05，与B组比较

图3 各组大鼠海马内syntaxin-1 表达水平

3 讨 论

甲减是血清T3、T4水平下降的一种常见的内分泌疾病，各个年龄段均可发病[5]。既往研究证实，甲状腺激素缺乏可导致新生大脑发生不可逆的损伤。即使及时补充了甲状腺激素，儿童期语言能力、智商得分也低于正常孩子，上述现象表明甲状腺激素与神经系统的发育相关[6]。

研究表明，甲状腺激素调节大脑末端分化过程。甲减状态下大脑发生明显的变化，如大脑皮质和小脑浦肯野细胞的神经纤维的发育迟缓，数量减少[7]。成年甲减能导致不同程度认知功能及相关脑区的损害，此种损害通过给予左旋甲状腺素(LT4)进行替代治疗能得到一定程度的修复。至于甲减患者的认知功能是否能够完全恢复存在争议，甚至有观点质疑左旋甲状腺素常规剂量替代治疗甲减的效果，因此亟待挖掘治疗甲减的新药，为甲减的治疗提供新的思路。

在制备甲减模型的实验动物中，大鼠应用最多[8-11]。因为大鼠的甲状腺机能与脑部发育过程与人类的相似度最高，可模拟和重现人类甲减的自然病程，只不过造模所需时间更长，一般需要4～6周。本研究选择SD雄性大为造模对象，是为排除雌激素对甲状腺激素合成和分泌的影响，而且造模周期符合传统造模周期。另外，在诱导甲减模型的化学药物中，丙硫氧嘧啶(PTU)化学诱导法应用频率最高其通过抑制甲状腺激素的合成的关键酶过氧化物酶来发挥作用的[9]。PTU的给药途径可以是口服或注射，本研究对SD雄性大鼠采取持续腹腔注射PTU(1 mg/100 g)6周的方法进行造模，从表3可以看出，B组大鼠的T3、T4水平明显低于A组，该结果提示大鼠甲减模型制备成功。

目前，在行为神经科学研究中，啮齿类动物的学习与记忆能力的评估常选用是国际通用的水迷宫实验[12]。本研究采用水迷宫实验对各组大鼠的认知功能进行评估，结果发现，与A组相比，B组大鼠的逃避潜伏期和游泳路程明显延长、游泳速度明显变慢。结果表明B组的学习和记忆能力呈下降趋势。经过药物干预后C、D组的逃避潜伏期和游泳路程明显缩短，游泳速度明显增快，可见，如大部分报道所示，LT4具有改善脑功能，提高记忆能力的作用。本研究结果显示，联合组治疗组效果更明显，分析原因而且可能与单纯使用LT4 比较，多奈哌齐的加入能够更有效地恢复树突棘数量增加TRs的结合率，从而发挥更大的生理效应。

值得注意的是，为从分子水平对LT4的治疗甲减的可能机制进行探讨，本研究以大鼠海马突触小体内syntaxin-1蛋白为切入点。 syntaxin-1 蛋白在中枢神经系统神经递质释放过程中起到重要的调节作用[13]。研究显示甲减大鼠不同的组织部位syntaxin-1 表达水平不太统一，究其原因可能与不同组织对甲状腺激素缺乏的反应性有差异有关[14]。本研究结果显示，与正常对照组组比较，甲减组大鼠前额叶皮质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ层syntaxin-1的表达是明显降低的，与该组T3、T4 水平下降是一致的。经过LT4和LT4联合多奈哌齐治疗后syntaxin-1 表达恢复至对照组水平，与此对应的血清LT4和LT3也恢复至对照组水平。且记忆和学习能力等行为学指标也有改善。该结果提示：甲状腺激素和多奈哌齐对 syntaxin-1 蛋白表达呈正性调节，甲状腺激素替代治疗使其恢复行为学的异常。然而，与单纯甲状腺激素替代治疗相比，LT4联合多奈哌齐治疗后syntaxin-1蛋白表达有恢复得更理想的趋势，其光密度绝对值更接近正常对照组。分析原因可能与多奈哌齐的加入有关。多奈哌齐是第二代胆碱酯酶(AChE)抑制剂，通过抑制胆碱酯酶的活性减少ACh的水解，从而升高Ach水平。临床上常用来治疗阿尔茨海默病，该病的特点就是记忆的进行性衰退，是一种中枢退行性疾病，研究显示，多奈哌齐可延缓阿尔茨海默病中海马的萎缩进程，起保护神经的作用。有学者也尝试单独用多奈哌齐治疗甲减动物获得成功，然而，具体机制尚不明确。有学者指出与抑制AChE有关，但有些学者提出相反意见，因为其他一些具有抑制中枢AChE的药物如新斯的明并不能起到保护神经的作用。 有的学者认为多奈哌齐可能通过激活海马内神经营养素受体发挥神经保护作用[15]。

综上所述，成年期甲减大鼠的学习和记忆能力是下降的，与海马内syntaxin-1 表达水平减少有关，而甲状腺素可以在一定程度上改善甲减大鼠的行为学指标，与上调syntaxin-1表达水平有关，尤以甲状腺素联合多奈哌齐为甚。然而，由于检测指标的局限，尤以甲状腺素联合多奈哌齐是怎么保护神经的？究竟多大的联合剂量才是保护神经的最佳剂量？本研究尚未探明，需设计更加周密而详尽的方案继续深入研究。

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Effectoflevothyroxinecombinedwithdonepezilhydrochlorideinadultratswithhypothyroidismanditsmechanism

FengJia1,MaChangyi1,ZhangYanzhen2

(1.DepartmentofBreastandThyroidSurgery,theSecondPeople′sHospitalofYibin,Yibin,Sichuan644000,China;2.DepartmentofBreastSurgery,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo investigate the effect and potential mechanism of levothyroxine combined with donepezil hydrochloride in adulthood hypothyroidism rats.MethodsA total of 60 male SD rats was divided by random number table into group A,group B,group C and group D,15 rats in each group.The rats in group B,group,C and group D were treated with PLT to prepare hypothyroidism model,and group A was used as the control group.After successful preparation of the model,rats in group C and group D were injected intraperitoneally with levothyroxine(6 g/100 g) every day,and then group D was given another 0.005% donepezil in drinking water.After 2 weeks,the learning and memory behavior of rats was observed by Morris water maze;the levels of serum T3 and T4 were measured by radioimmunoassay;the expression of syntaxin-1 in hippocampus was detected by immunohistochemistry and Western blot.ResultsThe escape latency and swimming distance of rats were prolonged significantly in group B but shorted significantly in group C and group D,and swimming speed was significantly slowed in group B but significantly strengthened in group C and group D;the levels of T3 and T4 were obviously decreased in group B but increased significantly in group C and group D,especially in group D.The results of immunohistochemistry and Western blot showed that the expression level of syntaxin-1 in hippocampus of rats was lower in group B compared to control group but increased significantly in both group C and group D.ConclusionLevothyroxine combined with donepezil hydrochloride can improve the learning and memory ability in adult rats with hypothyroidism,and its mechanism is related to the increase of expression of synaptotagmin-1 in hippocampus.

levothyroxine;donepezil hydrochloride;hypothyroidism;syntaxin-1;rats,Sprague-Dawley

冯佳(1980-)，主治医生，本科，主要从事乳腺外科方面的研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.006

R581.2

A

1671-8348(2017)32-4484-04

2017-04-12

2017-06-13)