青蒿素对大鼠脑缺血再灌注损伤后凋亡相关因子及炎症介质表达的影响

袁红刚

（汉川市人民医院神经外科，湖北 汉川 431600）

青蒿素对大鼠脑缺血再灌注损伤后凋亡相关因子及炎症介质表达的影响

袁红刚

（汉川市人民医院神经外科，湖北 汉川 431600）

目的 探讨青蒿素对大鼠脑缺血再灌注损伤后凋亡因子及炎症介质表达的影响。方法 采用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型，健康SD大鼠随机分为假手术组、模型组、青蒿素预处理组。缺血2 h，再灌注24 h后，处死大鼠，脑组织取材。采用实时荧光定量PCR检测Fas、FasL、Bcl-2、Bax mRNA水平。采用ELISA法检测TNF-α和IL-1β蛋白水平。结果 与假手术比较，模型组Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA表达水平上调(P＜0.05)，Bcl-2/Bax比值下调(P＜0.05)，TNF-α和IL-1β蛋白水平升高(P＜0.05)，青蒿素预处理可明显下调Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA水平及TNF-α和IL-1β蛋白水平(P＜0.05)，上调Bcl-2/Bax比值(P＜0.05)。结论 青蒿素对脑缺血再灌注损伤后的脑组织具有保护作用。

青蒿素；Bcl-2；Bax；肿瘤坏死因子α；脑缺血再灌注损伤

缺血性脑血管病严重危害人类健康。近年来，脑缺血再灌注后细胞凋亡一直是研究的热点，然而其发生机制目前尚不明确。目前已经确认的是，细胞凋亡不仅受凋亡相关因子的调控，还被许多内外因素所调节，包括氧化应激、炎症反应等。因此有效地减少脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡[1-3]，可以减轻缺血再灌注对脑组织的损伤，有助于神经功能的恢复。青蒿素是一种菊科植物黄花蒿中提取物，是世界卫生组织公认的抗疟疾药物。大量的研究证实，青蒿素还具有多重生物学效应，如免疫调节、抗炎症、抗凋亡及抗纤维化等。本研究通过线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型，观察青蒿素预处理对脑缺血再灌注损伤后Fas、FasL、Bcl-2、Bax RNA水平及TNF-α和IL-1β蛋白水平的影响，探讨青蒿素脑保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物与分组 SPF级健康Sprague-Dawley雄大鼠80只，8周龄，体质量250～300 g。由武汉大学实验动物中心提供。随机分成3组，即假手术组（n=20）、模型对照组（n=30）、青蒿素组（n=30）。

1.2 模型制作 参照Zea线栓法（Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats），3%戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉大鼠，麻醉剂量为40～50 mg/kg。将大鼠固定于鼠板上，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉，顺着右侧颈总动脉经颈内动脉插入制备好的线栓，直到遇到阻力为止，阻断大脑中动脉血流2 h,拔出线栓，形成再灌注。假手术除了不插入线栓，其他步骤与另外两组一致。再灌注24 h处死大鼠，脑组织取材。

1.3 给药途径 青蒿素组在造模1周前给予青蒿素灌胃，剂量为5 mg/（kg·d）。

1.4 实时荧光定量PCR检测大鼠脑组织Fas、FasL、Bcl-2、Bax RNA表达 取大鼠脑组织 Trizol法，严格按照说明书提取总mRNA。Fas：上游引物5´-GTG ATG AAG GGC ATG GTT TAG-3´，下游引物5-´GCA TTT GGT GTT GCT GGT T-3´；FasL：上游引物5´-ACC ACC TCC ATC ACC ACT ACC-3´，下游引物5´-CAT TCC AAC CAG AGC CAC C-3´；Bcl-2：上游引物5´-TTT GAT TTC TCC TGG CTG TCT-3´´，下游引物5´-CTG ATT TGA CCA TTT GCC TG-3´；Bax：上游引物5´-TGA ACT GGA CAA CAA CAT GGA G-3´，下游引物 5´-AGC AAA GTA GAA AAG GGC AAC C-3´；β-actin：上游引物5´-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CCT C-3´，下游引物5´-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3´。

1.5 脑组织TNF-α和IL-1β水平检测 脑损伤后24 h小时分别断头处死6只，在冰上分离右顶伤灶附近脑组织，置于冷生理盐水中漂洗称重，然后研磨匀浆，以3 500 r/min、-4℃离心10 min,提取上清液后按照ELISA试剂盒进行操作。

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，计量资料采用“x±s”表示，各组样本均数采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Fas和FasL mRNA表达 与假手术组比较，模型组Fas和FasL mRNA表达水平显著上调，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，青蒿素组Fas和FasL mRNA表达显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 Fas和FasL mRNA水平Figure1 Fas and FasL mRNAlevels

2.2 Bcl-2和Bax mRNA表达 与假手术比较，模型组Bcl-2和Bax mRNA水平显著上调，Bcl-2/Bax比值显著下调，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，青蒿素组Bcl-2 mRNA水平和Bcl-2/Bax比值显著上调，Bax mRNA水平显著下调，且差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 A.Bd-2和Bax mRHA水平；B.Bcl-2/Bax比值Figure 2 A.bd-2 and Bax mRHAlevel;B.Bcl-2/Bax ratio

2.3 TNF-α和IL-1β水平与假手术比 模型组TNF-α和IL-1β水平均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，青蒿素组TNF-α和IL-1β水平均降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 3组TNF-α和IL-1β水平比较（x±s）Table 1 Comparison of TNF-alpha and il-1 beta levels in 3 groups(x±s)

3 讨论

本研究在大鼠脑缺血再灌注损伤模型的基础上，给予青蒿素对其进行干预，结果显示，与假手术比较，模型组Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA表达水平上调，Bcl-2/Bax比值下调，TNF-α和IL-1β蛋白水平升高，青蒿素干预可明显下调Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA水平及TNF-α和IL-1β蛋白水平，上调Bcl-2/Bax比值，提示青蒿素可通过抑制神经细胞凋亡及炎症反应来发挥神经保护作用[4-6]。

细胞凋亡是受基因调控的主动性死亡。大量的研究表明，细胞凋亡参与缺血引起的神经细胞死亡。脑组织缺血时，缺血中心细胞快速的发生坏死，半影区则主要以凋亡的机制发生迟缓性细胞死亡[7-10]。Fas属于肿瘤坏死因子的受体家族成员，是一种具有重要功能的细胞表面受体，其与FasL相互作用可介导缺氧所致的细胞凋亡。Fas是参与脑缺血后神经细胞凋亡的重要因素之一，另外，Fas/FasL通路的激活还介导Caspase-3的激活。本研究结果显示，青蒿素预处理可以降低脑缺血再灌注损伤后的Fas和FasL mRNA表达水平。Bcl-2是抑制细胞凋亡的关键基因，其还可以调节Ca2+流入细胞，抑制氧自由基的产生。Bax是细胞凋亡的促进基因[11-12]，并对抗Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用。Bcl-2与Bax表达的比值决定着细胞在受到凋亡刺激信号后的存亡。在脑缺血再灌注后，Bcl-2/Bax比值降低时促进细胞凋亡，比值升高时促进细胞存活。本研究中，青蒿素干预脑缺血再灌注损伤可上调Bcl-2 mRNA表达及Bcl-2/Bax比值，同时下调Bax mRNA表达，抑制细胞凋亡，从而保护了脑组织。

本研究还发现给予青蒿素预处理可减少脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织中TNF-α和IL-1β蛋白水平。脑缺血激发的炎症级联反应在缺血再灌注损伤中发挥着中要用。目前已经证实，短暂性脑缺血就会诱导TNF-α和IL-1β等促炎症因子的表达。TNF-α是体内最主要的炎症因子，TNF-α过度表达可直接作用的血管内皮细胞，改变其通透性，还刺激内皮细胞合成并释放IL-1β。TNF-α过度表达还可诱导细胞凋亡。TNF-α引发一系列炎症介质的始发因素，对脑缺血后脑组织具有损害作用。IL-1β是一种多功能的细胞因子，在正常脑组织中只有少量表达，其在正常中枢神经系统发育和脑对各种损伤的反应中发挥重要作用。IL-1β不仅可以促进T、B细胞活化，还可以诱导TNF-α、IL-6等炎症因子的产生。IL-1β参与脑水中形成及神经元坏死。我们有理由相信本研究结果表明的青蒿素预处理能降低脑缺血再灌注损伤后炎症介质TNF-α、IL-6的表达，能减少其过度释放导致的脑细胞继发性损伤，有助于神经功能的恢复。

综上所述，本研究观察青蒿素能降低脑缺血再灌注损伤后凋亡因子及炎症介质的表达，证明青蒿素具有脑细胞保护作用，从分子水平对其作用机制研究的一种扩充，但具体机制仍有待于进一步研究，为临床开展脑保护治疗提供新思路。

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Effects of artemisinin on expression of apoptosis-related factors and inflammatory mediators

Yuan Hong-gang
(Neurosurgery of hanchuan people's hospital,Hanchuan,Hubei,431600,China)

Objective To observe of artemisinin on expression of apoptosis-related factors and inflammatory mediators.Methods 80 male adult Sprague-Dawley rats were randomly assigned into 3 groups：sham group,model group and artemisinin group.The middle cerebral artery occlusion reperfusion model was made by the suture method(ischemia for 2 hour and reperfusion for 24 h).After that were sacrificed by decapitation,the mRNA level of Fas,FasL,Bcl-2,Bax were measured by real time RT-PCR,the level of TNF-α and IL-1β were measured by ELISA.Results The level of Fas,FasL,Bcl-2,Bax,TNF-α and IL-1β were increased significantly in rats with focal cerebral ischmeia-reperfusion(P＜0.05).Compared with the model group,The level of Fas,FasL,Bax,TNF-α and IL-1β were decreased significantly in rats of artemisinin group(P＜0.05),the Bcl-2 was up regulated(P＜0.05).Conclusion Artemisinin exert a protective effect against focal cerebral ischmeia-reperfusion via reducing apoptosis and inflammation.

Artemisinin;Bcl-2;Bax;TNF-α;Cerebral ischmeia-reperfusion

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.33.010