贵州马铃薯引进品种SSR分子标记及遗传多样性分析

， ， ， ， ， ， (.贵州省种子管理站， 贵阳 55000； .贵州大学， 贵阳 55005；.贵州省生物技术研究所， 贵阳 550006)

贵州马铃薯引进品种SSR分子标记及遗传多样性分析

李恩宏1，贾长城2，杨丽娜1，滕安平1，冯浪1，朱英3，李飞3
(1.贵州省种子管理站， 贵阳 550001； 2.贵州大学， 贵阳 550025；3.贵州省生物技术研究所， 贵阳 550006)

为了鉴定马铃薯品种间的亲缘关系，采用5对SSR分子标记引物，对18个贵州马铃薯生产品种进行SSR分子标记及遗传多样性分析。结果表明：5对SSR引物共扩增出77个多态性条带，每个组合的多态性条带数为10～24不等，平均每个引物组合产生15.4个多态性条带。18个马铃薯材料之间的遗传距离范围在0.376 6～0.909 0之间，平均为0.701 1。经聚类分析，18个马铃薯材料在遗传距离0.57水平上全部聚为一类，以遗传距离0.60为基准，可明显聚为4个类群。第Ⅰ类包括5个材料；第Ⅱ类仅1个材料；第Ⅲ类包括4个材料；第Ⅳ类包括8个材料。

马铃薯； 品种； 标记； 遗传多样性

贵州是马铃薯生产大省，马铃薯种植面积已经突破“1 000万亩”大关，种植面积常年稳居全国前三甲，马铃薯产业也被列入贵州特色优势扶贫产业。近年来，马铃薯品种更新换代的步伐加快，优质高产的马铃薯品种需求量大，选择优质高产品种迫在眉睫，快速准确的选择品种成为今后推广优质品种的主要途径。传统的马铃薯品种鉴别采用生物形态学的方法，所需周期较长，品种间较小的差异不易区别，误差也较大。因此，为了了解马铃薯品种间的亲缘关系和遗传背景，规范马铃薯质量管理，保证马铃薯质量，助推马铃薯产业良性发展，必须对马铃薯引进品种进行分子标记指纹图谱分析，同时为今后马铃薯品种引种推广、亲本选择、品种选育预测提供理论依据。

SSR分子标记具有多态性高、多等位基因信息量高、遗传共显性、检测效率高等特点，目前被广泛用于马铃薯品种指纹图谱构建、遗传关系分析、品种鉴定、多态性检测等[1]。在SSR分子标记与遗传多样性分析方面，国内已经有许多的研究和报道，段艳凤等[2]利用10对SSR引物构建了中国88个马铃薯审定品种的指纹与遗传多样性分析；李先平等[3]利用SSR分子标记对30份彩色马铃薯种质材料遗传关系进行了分析，可作为极好的遗传资源在杂交上予以利用，扩大和丰富彩色马铃薯种质遗传背景；黄先群等[4]利用9对SSR引物对12个引进品种、12个费乌瑞它自然和辐射变异材料进行了遗传多样性分析；李飞等[5]利用SSR分子标记对8个马铃薯新品种进行了遗传分子和指纹图谱构建；谢春梅等[6]应用SSR分子标记技术鉴定了马铃薯实生种子的纯度；唐铭霞等[7]利用SSR标记对四川省现有及引进的马铃薯品系(种)42份进行了遗传多样性分析；王绍鹏等[8]采用SDS提取液提取的马铃薯DNA，质量好、无降解，满足SSR分子标记的要求。利用4对引物对黑龙江省7个主栽品种进行了分析标记。刘建霞等[9]利用SSR对山西省12份马铃薯主栽品种进行了遗传多样性分析。上述研究表明，SSR分子标记已经成为马铃薯遗传多样性、马铃薯纯度鉴定、马铃薯亲缘关系分析的主要技术手段。因此，为了鉴定贵州省种子管理站提供的18个马铃薯引进品种之间的遗传多样性，本研究利用段艳凤等[2]从138对SSR引物中筛选的5对多太性高、条带清晰的引物对参试材料进行遗传多样性分析，从而为马铃薯品种选育、种质资源利用、品种权保护等方面提供一定的理论依据。

表1 参试马铃薯品种信息汇总

序号样品编号品种名称级别被抽查单位来源1WJC2016⁃09001337常规种威宁县南方马铃薯专业合作社雪山合作社2WJC2016⁃09002宣薯2号二级种威宁县南方马铃薯专业合作社威宁县南方马铃薯专业合作社3WJC2016⁃09003威芋5号二级种威宁县南方马铃薯专业合作社威宁县高原农产品农民专业合作社4WJC2016⁃09004威芋3号原种威宁县南方马铃薯专业合作社盘县农科所5WJC2016⁃09005盘薯4号原种威宁县南方马铃薯专业合作社盘县农科所6WJC2016⁃09006云薯505常规种威宁县南方马铃薯专业合作社雪山合作社7WJC2016⁃09007丽薯6号常规种威宁县南方马铃薯专业合作社威宁县高原农产品农民专业合作社8WJC2016⁃09008青薯9号一级种威宁县南方马铃薯专业合作社威宁县高原农产品农民专业合作社9WJC2016⁃09009丽薯107原种威宁县南方马铃薯专业合作社贵州百谷丰薯业有限公司10WJC2016⁃090010云薯401原种威宁县南方马铃薯专业合作社贵州百谷丰薯业有限公司11WJC2016⁃090011东北洋芋常规种威宁县南方马铃薯专业合作社自繁12WJC2016⁃090012中薯3号常规种威宁县南方马铃薯专业合作社自繁13WJC2016⁃090013荷兰薯7号原种威宁县南方马铃薯专业合作社威宁泰丰科技实业有限公司14WJC2016⁃090014荷兰薯15原种威宁县南方马铃薯专业合作社贵州百谷丰薯业有限公司15WJC2016⁃09015鄂薯5号原种威宁县南方马铃薯专业合作社贵州百谷丰薯业有限公司16WJC2016⁃090016新大坪常规种威宁县南方马铃薯专业合作社自繁17WJC2016⁃09017恒薯1号原原种贵州恒丰科技有限公司自繁18WJC2016⁃09018滕育1号原种威宁县新街农产品专业合作社山东腾州

1 材料与方法

1.1 试验材料

2016年抽取马铃薯样品18份，每份4粒马铃薯(详见表1)，利用马铃薯薯块提取DNA。

1.2 DNA提取

每份试验材料取少量马铃薯薯块，利用CTAB法提取样本DNA。样品稀释到25 ng/μL，置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 分子标记引物

试验选用引物是段艳凤等[2]从中国88个马铃薯审定品种中的138对SSR引物中筛选的5对多态性高、条带清晰的引物(表2)。

表2 试验SSR引物名称和序列

引物名称上游引物(5’⁃3’)下游引物(5’⁃3’)S118AGAGATCGATGTAAAACACGTGTGGCATTTTGATGGATTS170CGCAAATCTTCATCCGATTCTCCGGCGGATAATACTTGTTS180ACTGCTGTGGTTGGCGTCACGGCATAGATTTGGAAGCATCS184TCATCACAACGTGACCCCAGGGCTTGAATGATGTGAAGCTCS192ACTTCTGCATCTGGTGAAGCGGTCTGGATTCCCAGGTTG

1.4 SSR-PCR扩增

PCR扩增体系20μL，含25 ng/μL DNA模板2.0μg/μL、10 pmol/μL上游primer 0.8μL、10 pmol/μL下游primer 0.8μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.6μL、10×PCR buffer 2.0μL、TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4μL、ddH2O 12.4μL。TaqDNA聚合酶为Tiangen公司产品。反应程序为94 ℃模板预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s(退火温度范围为53～64 ℃)，72 ℃延伸45 s，35个循环；最后72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用10%的变性PAGE电泳检测。电泳结束后用硝酸银染色观察结果。

注：M为Marker，由下到上分别是100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、700 bp、1 000 bp。泳道1～18分别代表：WJC 2016-09001、WJC 2016-09002、WJC 2016-09003、WJC 2016-09004、WJC 2016-09005、WJC 2016-09006、WJC 2016-09007、WJC 2016-09008、WJC 2016-09009、WJC 2016-090010、WJC 2016-090011、WJC 2016-090012、WJC 2016-090013、WJC 2016-090014、WJC 2016-090015、WJC 2016-090016、WJC 2016-09017、WJC 2016-09018。下同。图1 引物S 170、S 184对18个马铃薯材料DNA的SSR扩增带型

图2 引物S 118、S 180对18个马铃薯材料DNA的SSR扩增带型

图3 引物S 192对18个马铃薯材料DNA的SSR扩增带型

1.5 数据分析

SSR扩增谱带在相同迁移率位置上有带记为1、无带记为0，组成原始矩阵。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性分析

采用5对扩增多态性较好较好的SSR对18个马铃薯材料进行扩增，结果表明，共扩增出77个多态性条带(图1～图3)，每个组合的多态性条带数为10～24不等，平均每个引物组合产生15.4个多态性条带。

2.2 参试品种的遗传相似性

根据5对SSR引物扩增得到的条带，建立1和0型数据，计算获得18份马铃薯材料之间的遗传距离(表3)，范围在0.376 6～0.909 0之间，平均为0.701 1。其中，材料“WJC 2016-09002(宣薯2号)”和“WJC 2016-09007(丽薯6号)”之间的遗传距离最小(为0.376 6)，说明其遗传关系最近，而材料“WJC 2016-090014(荷兰薯15)”和“WJC 2016-09018(滕育1号)”之间的遗传距离最大(为0.909 0)，说明其遗传关系最远。

2.3 参试品种的遗传聚类图

由图4可以看出，18份马铃薯材料在遗传距离0.57水平上全部聚为一类。以遗传距离0.60为基准，可分为四大类。第Ⅰ类包括WJC 2016-09001(337)、WJC 2016-09003(威芋5号)、WJC 2016-09009(丽薯107)、WJC 2016-090010(云薯401)、WJC 2016-090011(东北洋芋)等5个材料；第Ⅱ类仅WJC 2016-09007(丽薯6号)1个材料；第Ⅲ类包括WJC 2016-09002(宣薯2号)、WJC 2016-09004(威芋3号)、WJC 2016-09005(盘薯4号)、WJC 2016-09008(青薯9号)等4个材料；第Ⅳ类包括WJC 2016-09006(云薯505)、WJC 2016-009012(中薯3号)、WJC 2016-090013(荷兰薯7号)、WJC 2016-090014(荷兰薯15)、WJC 2016-090015(鄂薯5号)、WJC 2016-090016(新大坪)、WJC 2016-09017(恒薯1号)、WJC 2016-09018(滕育1号)等8个材料。

表3 18份马铃薯材料间的遗传距离

WJC2016⁃09001WJC2016⁃09002WJC2016⁃09003WJC2016⁃09004WJC2016⁃09005WJC2016⁃09006WJC2016⁃09007WJC2016⁃09008WJC2016⁃09009WJC2016⁃090010WJC2016⁃090011WJC2016⁃090012WJC2016⁃090013WJC2016⁃090014WJC2016⁃090015WJC2016⁃090016WJC2016⁃09017WJC2016⁃09018WJC2016⁃090011．0000WJC2016⁃090020．50651．0000WJC2016⁃090030．68830．50651．0000WJC2016⁃090040．66230．58440．63641．0000WJC2016⁃090050．44160．70130．54550．67531．0000WJC2016⁃090060．66230．58440．66230．58440．57141．0000WJC2016⁃090070．66230．37660．61040．58440．46750．61041．0000WJC2016⁃090080．72730．67530．54550．70130．61040．64940．54551．0000WJC2016⁃090090．88310．44160．67530．59740．42860．64940．67530．66231．0000WJC2016⁃0900100．71430．58440．71430．63640．51950．61040．45450．67530．72731．0000WJC2016⁃0900110．63640．48050．66230．58440．54550．55840．58440．51950．67530．61041．0000WJC2016⁃0900120．58440．66230．61040．71430．64940．66230．45450．57140．51950．63640．66231．0000WJC2016⁃0900130．62340．62340．54550．64940．63640．70130．51950．55840．61040．67530．54550．80521．0000WJC2016⁃0900140．59740．59740．57140．67530．63640．70130．51950．55840．58440．67530．57140．80520．89611．0000WJC2016⁃0900150．50650．58440．58440．55840．64940．61040．40260．49350．46750．55840．63640．76620．62340．67531．0000WJC2016⁃0900160．53250．61040．61040．50650．62340．71430．50650．54550．54550．63640．58440．68830．70130．75320．66231．0000WJC2016⁃090170．61040．50650．68830．66230．64940．61040．50650．54550．54550．61040．55840．68830．62340．59740．61040．66231．0000WJC2016⁃090180．53250．58440．53250．61040．59740．66230．45450．51950．51950．61040．55840．79220．83120．90910．71430．79220．61041．0000

图4 18份马铃薯材料聚类图

3 结 论

李丽等[10]利用10对SSR引物构建了38份参试材料的指纹图谱，并进行遗传多样性分析。结果表明:共检测到113个等位位点，其中64个为多态性位点，多态性比率为57%。每对SSR引物扩增的多态性位点数为4～12个，平均6.4个，多态性信息量变化为0.144 5～0.937 0，平均0.509 8；经聚类分析，,在遗传相似系数0.61处，所有参试材料可明显分为3个类群。贵州马铃薯不同品种间的遗传基础较狭窄，同一单位提供的品种遗传关系相近。本次试验采用段艳凤等[2]的方法从138对SSR引物中筛选出的5对多态性高、条带清晰的引物，所有参试品种均可分开，说明采用SSR标记构建马铃薯品种DNA指纹图谱是可行的，DNA指纹图谱的建立，有助于马铃薯种薯质量管理，打击假冒侵权品种。

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SSR Molecular Markers and Genetic Diversity Analysis of Potato Introduced Varieties in Guizhou

LIEnhong1,JIAChangcheng2,YANGLina1,TENGAnping1,FENGLang1,ZHUYing3,LIFei3
(1.Seed Management Station of Guizhou Province,Guiyang 550001,China；2.Guizhou University,Guiyang 550025; 3.Guizhou Institute of Biotechnology,Guiyang 550006，China)

In order to identify the genetic relationship among potato cultivars,genetic diversity of 18 Potato Cultivars in Guizhou were analyzed by 5 pairs of SSR molecular marker primers.The results showed that 77 polymorphic bands were amplified by 5 pairs of SSR primers,and the number of polymorphic bands in each combination was 10-24.There were 15.4 polymorphic bands in each primer combination.The genetic distances between 18 potato materials ranged from 0.376 6 to 0.909 0,with an average of 0.701 1.By cluster analysis,18 potato samples were clustered into 4 groups at the 0.57 level of genetic distance.Based on the genetic distance of 0.60,they could be clustered into two groups.Category Ⅰ consists of 5 cultivars;Category Ⅱ only has 1 cultivar;Category Ⅲ consists of 4 cultivars;Category Ⅳ includes 8 cultivars.

potato； variety； marker； genetic diversity

2017-03-17

本研究由抗晚疫病马铃薯品种选育(黔科合NZ字[2012]3034)和马铃薯高产多抗新品种选育(黔农科院院专项[2014]033号)项目资助。

李恩宏(1982—)，男，贵州盘县人；学士，助理农艺师，主要从事马铃薯种薯质量管理、品种资源收集与分析研究；E-mail：31370487@qq.com。

李 飞，E-mail:gzlfei@sina.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.07.025

S 532

A

1001-4705(2017)07-0025-05