超声波微波协同提取青钱柳超微粉多糖及活性研究

应瑞峰，黄梅桂，*，王耀松，李婷婷，2，范龚健，吴彩娥

（1.南京林业大学轻工科学与工程学院，江苏南京210037；2.浙江森养道生物科技有限公司，浙江兰溪321100）

超声波微波协同提取青钱柳超微粉多糖及活性研究

应瑞峰1，黄梅桂1，*，王耀松1，李婷婷1，2，范龚健1，吴彩娥1

（1.南京林业大学轻工科学与工程学院，江苏南京210037；2.浙江森养道生物科技有限公司，浙江兰溪321100）

应用超声波微波复合法提取青钱柳叶超微粉多糖，试验在不同提取时间、液料比、超声波功率和微波功率等条件下测定多糖的提取率，选出最佳超声波-微波协同提取工艺。超声波微波辅助提取法的最佳工艺为超声功率360 W，微波功率100 W，处理时间20 min，多糖得率高达10.02%。对热水法和超声波微波法提取的多糖进行抗氧化，抗肿瘤和降血糖的活性测定，试验结果显示青钱柳多糖具有很强的抗氧化性，较弱的抗肿瘤活性和很强的α-葡萄糖苷酶抑制能力。超声波微波提取的青钱柳多糖其生物活性显著高于热水法提取的多糖。试验结果表明超声波微波提取法不但效率高，而且可以提高多糖的活性。

青钱柳；多糖；超声波；微波；降血糖

青钱柳又名青钱李，摇钱树等，是冰川世纪时期幸存下来的珍贵树种，是我国特有的植物，属于国家二级保护树种。青钱柳广泛分布于我国各地，比较集中分布在江西、湖北、浙江等地，生长在在海拔420～2500米的山区或石灰岩山地[1-2]。多年的研究发现青钱柳叶中含有多种活性成分，包括黄酮类物质、三萜类物质、多糖、有机酸类等，具有重要的生理活性功能，尤其青钱柳叶多糖，具有降血糖、降血压、抗氧化等多种重要的生物活性[3-8]。目前，植物多糖的提取主要包括热水浸提法和酸、碱提取法。热水浸提法成本低、操作简单，而且提取过程比较温和，多糖分子结构不被破坏，但提取得到的多糖往往得率低，含量也低的缺点。对于植物多糖的提取，可以加酸或加碱提高多糖的提取率，但强酸、强碱会引起多糖的糖苷键断裂，从而影响多糖的活性并且会造成环境污染。近年来，超声微波协同提取技术逐步被应用到植物活性多糖的辅助提取，超声波提取技术主要是利用超声波对溶剂的空化作用和次级效应，更易于植物多糖的浸出和扩散。微波辅助提取技术是利用微波射线能够辐射溶剂并加热植物细胞内部，破坏植物的细胞壁，使多糖更容易从细胞中释放出来，并溶解到溶剂中[9-10]。本研究应用超声波协同微波法对青钱柳叶超微粉进行多糖的提取，寻找最佳提取条件，最大限度地提高多糖得率，对提取得到的多糖进行活性研究，其研究结果能为青钱柳开发和综合利用提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青钱柳叶：由南京林业大学白马基地提供；实验用水为超纯水；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、DMSO：Sigma公司；96孔细胞培养板：Costar公司；RPMI 1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清：Gibco公司；Eno－GeneCellTMCounting Kit-8（CCK-8）细胞活力检测试剂盒：南京恩晶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

XO-SM200超声波微波复合反应系统：南京先欧仪器制造有限公司；QT-58A智能紫外检测仪：上海琪特分析仪器有限公司；激光粒度分析仪欧美克LSPOS（Ⅵ）：珠海欧美克仪器有限公司；TU-1800PC紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；XD-202荧光倒置生物显微镜：南京江南永新光学有限公司；Quanta 200环境扫描电镜：美国FEI公司；Thermo MK3酶标仪：美国热电公司。

1.3 提取方法与试验条件

1.3.1 超微粉碎法

利用喷射空气将青钱柳干叶加速到声速，粒子与壁面产生剧烈的冲击碰撞、摩擦、剪切使干叶粉碎。粉碎后的细料随上升气流传送到分级区，并从分级口出来，这部分颗粒为细粉，未被分级器分选的粗料重新返回粉碎。

1.3.2 激光粒度分析法

取1 g青钱柳叶微粉加入10 mL去离子水，制成悬浮液，用去离子水稀释至300 mL，充分分散，试验过程中转速为2 500 r/min，超声2 min，无气泡出现，试验重复3次。

1.3.3 扫描电子显微镜样品制备及观察

青钱柳叶颗粒干燥之后，镀金处理，扫描电镜观察。

1.3.4 提取步骤

多糖超声波微波法提取工艺：青钱柳→超微粉碎→超声波微波复合提取→过滤→80%醇沉→离心→沉淀复溶→透析→醇沉→干燥→多糖。

多糖热水法提取工艺：青钱柳→超微粉碎→热水提取→过滤→80%醇沉→离心→沉淀复溶→透析→醇沉→干燥→多糖。

1.3.5 单因素试验

提取时间的选择：取2.0 g的青钱柳干粉加入100 mL蒸馏水，提取过程超声波功率为360 W，处理10、20、30、40、50、60 min，测定多糖提取率；液料比对多糖提取率的影响：取青钱柳干粉，以 5、10、20、30、40 mL/g的液料比，360 W的超声波功率处理30 min，分别测定多糖得率；超声波功率对多糖提取率的影响：取青钱柳粉，按照液料比30 mL/g加入蒸馏水，超声功率分别为 120、240、360、480、600、720 W 条件下，超声波处理30 min，分别测定多糖提取率；微波功率对青钱柳多糖提取率的影响：取青钱柳粉，按照液料比30mL/g加入去离子水，分别在 100、200、300、400、500W条件下，超声波处理30 min，分别测定多糖提取率。

1.3.6 正交试验设计

在单因素试验的基础上，采用三因素三水平，按L9（34）正交设计进行青钱柳多糖热水提取正交试验，以总糖得率作为响应值，每组试验均重复3次。

1.4 多糖含量测定

采用苯酚－硫酸法，以葡萄糖为标准品，测定总糖含量。

1.5 活性试验条件

1.5.1 青钱柳多糖体外抗氧化活性

清除超氧阴离子的测定：将桑黄多糖用Tris-HCl缓冲液（pH8.0，16 mmol/L）溶解，制成不同浓度的样品溶液。氯化硝基四氮唑蓝（Nitrotetrazolium Blue chloride，NBT）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH） 均用 Tris-HCl缓冲液（pH8.0，16 mmol/L）溶解，浓度分别为 300、468 μmol/L；吩嗪硫酸甲酯（Phenazine methosulfate，PMS）用蒸馏水溶解，浓度为60 μmol/L。取1.50 mL不同浓度的样品溶液，0.50 mL NBT，0.5 mL NADH，混匀，并且加入0.5 mL的PMS，将样品换为1.50 mL的缓冲溶液作为空白对照，相同的操作方法，在25℃的水浴中放置5 min后测定吸光度（波长为560 nm），样品重复3次。超氧负离子清除率I的计算公式如下：

式中：I为样品对超氧负离子的清除率（Scavenging effect）；A样品为样品测试值；A空白为空白对照值。

清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH自由基）能力测定：称取样品分别配制成12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL 浓度的溶液。配制 0.1 mmol/L DPPH溶液。准确移取各个待测液2.0 mL于10 mL透明试管中。使用移液管分别加入2.0 mL，0.1 mmol/L DPPH溶液，用震荡机混匀，放置一段时间，再用紫外分光光度计测定517 nm波长处的吸光度，记为A样品。做3组平行试验。准确移取各浓度待测液2.0 mL与相应溶剂（水）2.0 mL，再用震荡机混匀，放置一段时间，测定在517 nm波长处的吸光度，记为A对照。准确移取DPPH溶液2.0 mL与相应溶剂（无水乙醇）2.0 mL，震荡机混匀，测定在517 nm波长处的吸光度，记为A空白。为了分析试验结果，VC作为阳性对照物，按以下公式计算DPPH自由基清除率：

式中：I为样品对DPPH自由基的清除率；A样品为样品测试值；A空白为空白值；A对照为对照值。

1.5.2 青钱柳多糖体外抗肿瘤活性

CCK-8染色法检测细胞活力：取活细胞进行实验，细胞增殖抑制试验采用EnoGeneCellTMCounting Kit-8（CCK-8）细胞活力检测试剂盒。孔板中每孔加入100 μL的细胞悬液，孔板在37℃，5%CO2培养箱中培养24 h，试验设立阴性对照组，溶媒对照组，阳性对照组，孔板在37℃，5%CO2培养箱中培养72 h后，孔内加入10μLCCK-8溶液，培养板在培养箱内孵育4 h，用酶标仪测定在450 nm处的OD值，计算样品对人宫颈癌细胞Hela细胞的抑制率。

式中：I为样品对宫颈癌细胞Hela细胞的抑制率；A样品为样品测试值；A空白为空白值。

1.5.3 青钱柳多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制测定

2 mL 0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）和1 mL 0.01 U/mL的α-葡萄糖苷酶加入空白试管中；1.5 mL 0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）与1.5 mL不同浓度的样品溶液和1 mL 0.01 U/mL的α-葡萄糖苷酶加入样品管中；2.5 mL 0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）和0.5 mL不同浓度的样品溶液加入背景管中。将空白管、样品管和背景管于37℃水浴15 min后，各管中加入1 mL，2.5 mol/L的底物（PNPG），于37℃水浴反应30 min后，各管中再加入4 mL，0.1 mol/L Na2CO3溶液终止反应，在波长405 nm处测定吸光值。不同浓度样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率根据公式计算：

式中：I为样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率；A样品为样品测试值；A空白为空白值；A背景为对照值。

1.6 数据分析

利用SPSS 12.0软件进行数据分析（t检验），分析组间差异。实验数据用±s表示。

2 结果与分析

2.1 超微粉碎青钱柳粒径分析

超微粉碎青钱柳粒径分析见图1。

图1显示经超音速气流粉碎后的青钱柳颗粒细小，粒度分布较窄，不存在较大组织块，颗粒粒径远小于 100 μm，颗粒分布区间大致为 0.30 μm～30 μm，因此此方法适合青钱柳干叶等这类热敏性及生物活性物质的粉碎。激光粒度分析仪测定青钱柳细粉的粒径[11-12]，青钱柳粒径为 0.2 μm～30 μm 的颗粒，平均粒径为 10 μm。

2.2 超声波微波协同作用

青钱柳叶微粉多糖的提取分析见图2。

图2 提取条件对青钱柳多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction conditions on the extraction yield of polysaccharides from Cyclocarya paliurus

图2显示青钱柳叶微粉多糖的提取率在热水提取的过程当中，随着液料比值的不断增大，得率会显著增高，较高的液料比加快了水的传质过程，当液料比为30mL/g时，青钱柳多糖得率最高。随着超声波功率的加大（≤360 W），多糖得率大幅的增加，功率在360 W时多糖的得率达到最高值。提取过程中，多糖得率随着超声波作用时间增加而增大，30 min内的增加趋势明显，30 min时达到最大值，30 min之后多糖得率反而缓慢下降。超声波作用于青钱柳时间太长，很可能会使青钱柳中的多糖成分受到一定的破坏，而使得率降低。微波功率在300 W时，多糖的提取率最高，超过300 W，提取率趋于稳定。

以超声波功率、提取时间和微波功率作为影响青钱柳多糖提取率的因素，在单因素试验的基础上，设计了L9（34）正交试验方案，进一步研究超声波微波协同提取青钱柳多糖的最优提取参数，结果见表1～表3。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

表2 正交试验设计与结果Table 2 Results and range analysis of orthogonal array design

表3 正交试验方差分析表Table 3 Analysis of variance in orthogonal array design

表1～表3显示，试验显著性最强的单因素为超声波功率，其次是提取时间。提取最优参数为：超声功率360 W，微波功率100 W，提取时间40 min，通过试验验证，在360 W超声功率，微波功率100 W，提取20 min时青钱柳多糖的提取率最高。由此并联系实际，可得出超声波微波辅助提取法的最佳工艺为超声功率360 W，微波功率100 W，在提取时间为20 min，液料比30 mL/g时，多糖得率高达10.02%。青钱柳超微粉超声波微波法多糖得率极显著高于热水法多糖得率4.51%（同等液料比与提取时间），并且其多糖含量为26.11%，显著高于青钱柳热水法18.23%。超声波微波辅助提取是基于超声波和微波场的瞬时穿透性加热方式进行提取的方法，使青钱柳干叶微粉在微波场作用下迅速产生大量热能，可加速叶内多糖由固体内部向固液界面扩散的速率。超声波微波提取显著地优于传统热水提取法，此项技术有效提高了提取的选择性，减少了提取时间。超声波微波协同条件下多糖的提取是一快速的组织崩解过程，这一过程使提取时间缩短，而且多糖得率和品质提高[11-12]。

2.3 青钱柳多糖活性研究

青钱柳叶多糖的抗氧化分析见图3和图4。

图3 青钱柳多糖对DPPH自由基的清除率曲线Fig.3 Scavenging curves of the polysaccharides from Cyclocarya paliurus DPPH radicals

图4 青钱柳多糖对超氧阴离子清除率曲线Fig.4 Scavenging curves of the polysaccharides from Cyclocarya paliurus superoxide anion radicals

在多糖提取率提高的情况下，试验对热水法和超声波微波提取的多糖进行清除DPPH自由基和清除超氧阴离子的活性测定（图3和图4），考察多糖活性的差异，试验结果显示随着青钱柳多糖浓度的逐渐增加，其清除DPPH自由基和超氧阴离子的能力增强，而且清除效果与青钱柳质量浓度之间存在明显的量效关系。虽然青钱柳多糖清除DPPH自由基和超氧阴离子的能力不及VC，但也呈现很强的抗氧化性。超声波微波提取的青钱柳多糖其抗氧化活性高于热水法提取的多糖。

青钱柳叶多糖的抗肿瘤分析见图5。

图5 多糖质量浓度对Hela癌细胞的抑制率Fig.5 Effects of different polysaccharide concentrations on inhibitive rate of cancel cell Hela

对热水法和超声波微波提取的多糖进行抗肿瘤对比试验（图5），青钱柳多糖对癌细胞HepG2有较弱的细胞毒活性，超声波微波提取的青钱柳多糖其抗肿瘤活性略强。

青钱柳叶多糖的α-葡萄糖苷酶抑制分析见图6。

图6 青钱柳多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.6 Inhibition rate of α-glucose glycoside by the polysaccharides from Cyclocarya paliurus

α-葡萄糖苷酶抑制剂用于治疗II型糖尿病，它是肠道吸收过程中的关键酶，淀粉等碳水化合物在α-葡萄糖苷酶的作用下转化为葡萄糖，通过小肠的吸收，进入血液。因此抑制ɑ-葡萄糖苷酶活性，能够延缓小肠消化吸收碳水化合物，对维持人类的血糖值有着重要作用[13-16]。如图6可见，当样液浓度在0～100 mg/mL范围时，青钱柳多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率随着样液浓度的增加而增加。浓度在90 mg/mL时，青钱柳多糖抑制率最高为97.9%，当样品浓度大于70 mg/mL时，青钱柳多糖对葡萄糖苷酶的抑制率已趋于平缓。青钱柳叶多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随着多糖浓度的增加，存在量效关系，其中超声波微波提取的多糖的 IC50值比较小，为（14.50±0.50）mg/mL，抑制活性极显著高于热水提取青钱柳多糖（21.10±1.02）mg/mL。试验结果表面，超声波微波协同提取法不但效率高，而且可以一定限度地提高多糖的活性。

3 结论

传统热水提取法，青钱柳叶超微粉多糖得率仅为4.51%，应用超声波微波复合法提取青钱柳叶超微粉多糖，有效提高了提取率，多糖得率高达10.02%。超声波微波辅助提取法的最佳工艺为超声功率360 W，微波功率100 W，处理时间20 min。两种方法提取的青钱柳多糖，进行了活性研究，发现通过超声波微波复合提取的青钱柳多糖有较好的抗氧化和降血糖活性。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(21卷)[M].北京:科学出版社,1979:18-19

[2]谢明勇,谢建华.青钱柳研究进展[J].食品与生物技术学报,2008,27(1):113-121

[3]Wang Q Q,Jiang C H,Fang S Z,et al.Antihyperglycemic,antihyperlipidemic and antioxidant effects of ethanol and aqueous extracts of Cyclocarya paliurus leaves in type 2 diabetic rats[J].Journal of Ethnopharmacology,2013,150(3):1119-1127

[4]XIE J H,DONG C J,NIE S P,et al.Extraction,chemical composition and antioxidant activity of flavonoids from Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja leaves[J].Food Chemistry,2015,186:97-105

[5]应瑞峰,季苏杰,李婷婷,等.青钱柳叶黄酮的分离纯化与抗氧化性研究[J].食品科技,2015,40(12):174-178

[6]XIE J H,XIE M Y,NIE S P,et al.Isolation,chemical composition and antioxidant activities of a water-soluble polysaccharide from Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja[J].Food Chemistry,2010(119):1626-1632

[7]KURIHARA H,ASAMI S,SHIBATA H,et al.Hypolipemic Effect of Cyclocarya paliurus(Batal)Iljinskaja in Lipid-Loaded Mice[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin,2003(26):383-385

[8]XIE J H,LIU X,SHEN M Y,et al.Purification,physicochemical characterisation and anticancer activity of a polysaccharide from Cyclocarya paliurus leaves[J].Food Chemistry,2013,136(3):1453-1460

[9]尹忠平,上官新晨,黎冬明,等.超声辅助提取青钱柳叶总三萜化合物研究[J].江西农业大学学报,2010,32(2):373-377

[10]Xie J H,Shen M Y,Xie M Y,et al.Ultrasonic-assisted extraction,antimicrobial and antioxidant activities of Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja polysaccharides[J].Carbohydrate Polymers,2012,89(1):177-184

[11]杨丽,袁春龙,马婧,等.不同粉碎条件的葡萄籽超微粉功能性成分及抗氧化性研究[J].食品工业科技,2014,35(20):178-181

[12]蔡亭,汪丽萍,刘明,等.超微粉碎对苦荞多酚及抗氧化活性的影响研究[J].中国粮油学报,2015,30(10):95-99

[14]黄明圈,上官新晨,徐明生,等.青钱柳多糖降血脂作用的研究[J].江西农业大学学报,2011,33(1):157-161

[15]刘月冉,耿越.植物多糖降血糖作用机制研究[J].食品与药品,2012,14(1):64-67

[16]罗祖友,胡筱波,吴谋成.多糖的降血糖与降血脂作用[J].食品科学,2007,28(10):597-600

Ultrasonic-Microwave Synergistic Extraction and Activity of Polysaccharides from Cyclocarya paliurus

YING Rui-feng1，HUANG Mei-gui1，*，WANG Yao-song1，LI Ting-ting1，2，FAN Gong-jian1，WU Cai-e1
（1.College of Light Industry of Science and Engineering，Nanjing Forest University，Nanjing 210037，Jiangsu，China；2.Zhejiang Senyangdao Biotechnology Co.，Ltd.，Lanxi 321100，Zhejiang，China）

Ultrasonic-microwave synergistic extraction of polysaccharides from Cyclocarya paliurus was proposed.The optimal conditions of extraction time，solvent-to-solid ratio，ultrasonic power and microwave power for extracting polysaccharides from Cyclocarya paliurus were studied，respectively.The combined use of ultrasonic and microwave provided a time-saving and high-yield method for polysaccharides extraction from Cyclocarya paliurus.The optimal conditions of extraction was ultrasonic power 360 W，microwave power 100 W and the treatment time 20 min，the yield extraction of polysaccharides was 10.02%.The antioxidant，antitumor activity and hypoglycemic activity of the polysaccharide from Cyclocarya paliurus were studied，the polysaccharides had very strong antioxidant ability，low antitumor activity and high hypoglycemic activity.The polysaccharide extracted by ultrasonic microwave method exhibited higher activity.The results showed the method was not only efficient，but also can improve the activity of polysaccharides.

Cyclocarya paliurus；polysaccharides；ultrasonic；microwave；hypoglycemic

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.006

国家自然青年科学基金资助项目（31600153）；南京林业大学引进高层次人才和高层次留学回国人员科研基金（GXL2013026）作者简介：应瑞峰（1982—），男（汉），副教授，博士，研究方向：天然产物。

*通信作者

2017-09-04