S-腺苷蛋氨酸通过降低Cav-1的表达保护KCl刺激引起的神经元损伤

杨俊霞，李燕强

(徐州医科大学江苏省麻醉学重点实验室, 江苏省麻醉与镇痛应用技术重点实验室，江苏 徐州 221004)

S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine，SAM，又称活性氨基酸)是1952年发现的广泛存在于体内的一种重要的生理活性物质。SAM是依赖甲基转移酶的酶促转甲基过程的甲基供体，修饰DNA、RNA 及组蛋白，进而影响DNA复制、转录和翻译、DNA错配修复，调节表观遗传[1]。质膜微囊结构蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)是位于细胞膜信号交易活跃的微域—小窝上的主要蛋白，能与多种信号分子形成复合物，对机体功能的调节发挥重要作用[2-4]。我们前期的研究结果表明，神经病理性疼痛状态下，小鼠前扣带回(anterior cingulate cortex，ACC) Cav-1 会持续表达增加，干扰Cav-1表达，疼痛减轻[5]。高浓度KCl可使细胞膜电位升高，细胞膜上的电压依赖型钙离子通道开放，胞内钙离子升高，激活细胞内多种信号通路，并调控相关转录因子发挥生物学效应。KCl刺激可使神经细胞产生长时程增强(long-term-potentiation，LTP)现象，神经细胞在LTP活动过程中会引发各类基因表达，并合成诸多蛋白质[6-7]。本研究采用KCl刺激原代培养的皮层神经元模型，检测SAM对KCl刺激引起的细胞损伤是否有保护作用，并进一步研究SAM是否通过降低Cav-1的表达，对KCl刺激引起的细胞损伤发挥保护作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 孕13～15 d小鼠，清洁级，由徐州医科大学实验动物中心提供。

1.1.2试剂 SAM (HPLC>99%,西安康诺化工有限公司)；KCl(上海生工生物科技有限公司)；DMEM 培养基、Neuroasal Medium、B-27 添加剂、胰酶(Life Technology Inc)；胎牛血清(Biochem 公司)；L-多聚赖氨酸、二甲基亚砜(Sigma 公司)；抗p-Cav-1 抗体、抗t-Cav-1 抗体(Bioword公司)；引物由上海吉玛基因有限公司合成；SYBR Green Master Mix (Invitrogen公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗、BCA蛋白测定试剂盒、ECL发光试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；其余为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1原代小鼠皮层神经元培养及各组神经元处理 取胎龄为13～15 d 的小鼠，无菌条件下分离出大脑皮层，在D-Hank′s 平衡盐溶液中漂洗3次，尽量剔除脑膜，剪碎后用终浓度为0.25%胰酶，37℃消化10 min，离心，弃上清，用含15%胎牛血清的DMEM 培养基制备成1.0×109·L-1密度的细胞悬液，接种于预先用L-多聚赖氨酸包被的培养板中，置37℃、5% CO2培养箱内孵育。d 2换成含2% B27的Neurobasal 继续培养，隔天换液。培养至d 7[8]，换液，KCl组为终浓度为0.05 mol·L-1KCl 作用12 h，SAM-KCl组为0.02 mol·L-1SAM预处理6 h后加入KCl(终浓度为0.05 mol·L-1)作用12 h。然后，将各组细胞用于后续实验。

1.2.2qPCR分析 将细胞用预冷的0.01mol·L-1PBS洗2遍，然后置于冰台上，用BBI公司B618133试剂盒提取总RNA，用vazyme试剂盒逆转成cDNA,调节每组样品到浓度一致，-20℃保存备用。取0.5 μL cDNA产物，按10 μL反应体系进行real-time PCR，各成分加入量：Cav-1或β-actin引物1.0 μL，cDNA 0.5 μL，5×SYBR GREEN 2 μL，DEPC水 6.5 μL。引物Cav-1: Forward 5′-ATTGCAGAACCAGAAGGGACAC-3′, Reverse 5′-CCATTGGGATGCCGAAGAT-3′, 产物121 bp；β-actin: Forward 5′-CATTGTTACCAACTGGGACGACAT-3′, Reverse 5′-GCCTCGGTGAGCAGCACA-3′, 产物102 bp。在95℃预变性1 min，按94℃ 30 s，59℃ 40 s，72℃ 40 s的参数进行PCR扩增，40个循环。然后记录Cav-1和β-actin的CT值，二者比值越大说明该样品含Cav-1拷贝数越少。CT值即达到一定荧光强度所经历的循环数。

1.2.3Western blot分析 将培养于6 孔板的各组细胞用冰冷的PBS洗涤2遍，每孔加入0.6 mL蛋白裂解液，刮取细胞，收集到1.5 mL EP管，冰上放置30 min，超声粉碎细胞，13 000 r·min-1离心10 min，取少量上清液，用BCA法测蛋白浓度，30 μg总蛋白分装成1管，-20℃保存。用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转移至PVDF膜上。经3% BSA封闭5～6 h后，加入适当稀释的一抗24 h,漂洗3遍再加入相应的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗。用ECL曝光法显示蛋白质条带。扫描免疫印迹胶片，并以Image J软件分析条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的水平。

2 结果

2.1SAM对各组神经元形态的影响0.05 mol·L-1KCl 作用于体外培养1周的小鼠皮层神经元12 h，可使神经元产生明显的损伤，突起缩短变细，胞体变小，细胞聚团。0.02 mol·L-1SAM预处理6 h可明显降低KCl刺激引起的细胞损伤(Fig 1)。

Fig 1 Effect of SAM on morphological characteristics of primary cultured neurons injured by KCl (×200)

A: Neurons soma in control group were rounded, translucent, neurite extended naturally; B: Neurons soma in KCl group was significantly smaller, wrinkled, neurite shortened; C: The soma and neurite of neurons in SAM-KCl group was obviously better than those in KCl group.

2.2SAM对各组神经元Cav-1mRNA表达的影响qPCR检测SAM对各组神经元Cav-1 mRNA表达的影响。Fig 2结果显示，KCl组Cav-1 mRNA表达较对照组明显升高(P<0.01),SAM-KCl组Cav-1 mRNA表达与KCl组相比降低(P<0.05),说明SAM能够逆转KCl引起的神经元Cav-1 mRNA表达升高。

Fig 2 SAM inhibited increases of Cav-1 mRNA of neurons induced by KCl(±s，n=5)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsKCl group

2.3SAM对各组神经元Cav-1蛋白表达的影响免疫印迹检测SAM对各组神经元Cav-1蛋白表达的影响。Fig 3结果显示，KCl刺激可使t-Cav-1和p-Cav-1蛋白表达上调(P<0.01)，SAM预处理可抑制KCl刺激引起的t-Cav-1和p-Cav-1蛋白表达上调(P<0.05)。

3 讨论

Fig 3 SAM reversed up-regulation of Cav-1 protein of KCl-injured neurons(±s，n=5)

A: The representative immunoblotting bands of Cav-1 protein of each group measured by Western blot; B: The quantitative data.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsKCl group

近年来，随着对SAM 在体内代谢过程认识的深入和大量临床研究，SAM维护神经健康的作用越来越受到重视。有研究发现，SAM的抗抑郁效果与三环类抗抑郁药相当，在单独使用或与其他抗抑郁药物合用时，可提高其他抗抑郁药的治疗效果[9]。特别是对5-羟色胺再摄取抑制剂类抗抑郁药的药效有增强效应。也有研究发现，SAM的抗抑郁效果还与叶酸含量有关，SAM 可与叶酸偶联，共同参与中枢神经递质( 如乙酰胆碱[10]) 的合成，SAM作为甲基供体参与脑组织和细胞的生理活动，影响各种神经递质的合成和代谢。SAM能够提高阿尔茨海默病模型TgCRND8小鼠脑中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性，增加还原型谷胱甘肽含量[11]。因此，SAM对维护人体健康至关重要。体内神经细胞的存活有赖于“电活动”或神经营养因子的“营养”作用，同样，体外原代培养的神经细胞维持存活也必须依赖于类似的“营养”作用。现已证明，大脑皮质神经细胞经KCl刺激诱导表现出LTP，KCl可使细胞膜电位升高，当神经细胞的膜电位上升到一定值时，细胞膜上的电压依赖型钙离子通道开放，引起细胞内多种信号通路的激活。比如细胞受KCl刺激后引起膜的去极化，细胞外钙内流，激活钙/钙调素依赖性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinase, CAMK)及Ras/MAPK途径，通过级联反应磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)，激活脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)发挥生物学效应。大脑皮质神经细胞经KCl刺激诱导表现出LTP，作为神经细胞活动最具特征性的表现方式，会引发各类基因表达并合成诸多蛋白质，从而使得神经细胞体现出不同的生物学功能[6-7,12]。Cav-1是质膜微囊结构蛋白的一种，是细胞质膜表面小窝的标记蛋白。Cav-1作为支架蛋白与多种信号分子组成信号分子复合物，参与信号转导、物质转运、细胞增殖等活动。研究表明，Cav-1在神经元突触的生长发育、多种生理和病理生理的信号转导中是必需的，Cav-1可募集谷氨酸受体和多种神经营养因子受体在膜上的锚定，增强神经元信号转导[13-14]。神经病理性疼痛状态下，小鼠ACC区Cav-1会持续表达增加[5]，那么在高浓度KCl刺激神经元时，Cav-1的表达是怎样的呢？

本研究首先从细胞形态上证实了SAM对高浓度KCl刺激引起的神经元胞体皱缩、突起变细变短有明显的改善作用。收集KCl刺激体外培养1周的小鼠皮层神经元12 h的总RNA和蛋白，qPCR和Western blot检测发现，Cav-1 mRNA和蛋白表达均升高。Cav-1具体是参与了KCl刺激细胞引起的膜去极化过程、或是钙内流、还是LTP形成有待进一步研究。SAM预处理神经元6 h组，再用KCl刺激神经元，不能引起Cav-1 mRNA和蛋白表达增高。说明SAM可抑制高浓度KCl引起的Cav-1表达增高，从而使神经元免受高浓度KCl引起的损伤。至于SAM是怎样调节高浓度KCl引起的Cav-1表达增高的，是通过甲基化Cav-1基因，还是通过某个信号通路的激活，有待进一步研究。

本研究证实了高浓度KCl刺激体外培养的小鼠皮层神经元，可使其Cav-1 mRNA和蛋白表达增高，SAM可抑制这种增高并起到保护神经元的作用。

(致谢：本实验在徐州医科大学麻醉学重点实验&麻醉与镇痛应用技术实验室完成，感谢实验室主任曹君利教授以及段雯珍、蔡衡、高甜慧老师在实验中给予的帮助。)

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