蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2调节香烟提取物诱导的肺上皮间质转化

沈辉娟，蒋俊霞，李芬芬，谢强敏，颜小锋

(浙江大学医学院1.附属第二医院药剂科,浙江 杭州 310009;2. 基础医学部,浙江 杭州 310058)

肺癌和慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)影响人类生活质量，发病率呈现逐年增加的趋势，是有必要关注的全球性健康问题。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肺癌和COPD的重要病理生理过程[1]。吸烟是引起EMT的重要因素[2]，有研究证实，用香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)刺激肺上皮细胞会增加IL-1α、IL-1β、IL-8、TNF-α、MMP-9 以及TGF-β1的表达[3-4]。然而，香烟所引起的EMT变化以及其潜在的机制还需进一步研究。Shp2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的一员，参与调控细胞增殖、迁移、分化和代谢转录[5]。EMT是细胞转分化的一种重要形式，提示Shp2在EMT过程中可能也发挥调控作用。在过去的20多年里，转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)已逐渐被明确为最重要的EMT诱导因子，并且成为近年来的研究焦点[6]。有研究证明，Shp2在TGF-β1诱导的EMT中发挥调节作用，但其是否调节香烟诱导的肺泡EMT尚未见报道。在本研究中，我们初步探讨Shp2在CSE诱导的EMT中的调节作用。

1 材料

1.1细胞株人Ⅱ型肺泡上皮细胞株A549细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2药物与试剂Shp2抑制剂苯基吡唑肼基磺酸盐(phenylhydrazonopyrazolone sulfonate 1，PHPS1)购自美国Sigma公司；3R4F标准香烟购自美国肯塔基大学烟草研究所；荧光二抗购自LiCOR公司(批号: 926-32211)；兔抗人E-钙黏蛋白 (E-cadherin)、波纹蛋白 (Vimentin)、α-肌动蛋白 (α-SMA)、 p-Smad2、Smad2均购自Cell Signaling公司；Shp2 siRNA购自上海吉玛公司；DMEM培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；TGF-β1酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；其他制剂均为市售AR级试剂。

1.3仪器CO2细胞培养箱:美国Thermo公司；BX51显微镜: 日本Olympus公司；7300实时荧光定量PCR仪: 美国ABI公司；Biophotometer核酸蛋白紫外分光光度计: 德国Eppendorf公司；IX70倒置显微镜:日本OLYMPUS公司；AG22331核酸蛋白测定仪: 德国Eppendorf公司；酶标仪: 美国ThermoFisher Scientific；Odyssey红外荧光扫描成像系统: 美国基因公司。

2 方法

2.1细胞培养A549细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养基(含2 mmol·L-1谷氨酰胺、10 kU·L-1青霉素、10 mg·L-1链霉素)中，37℃、5% CO2条件下常规培养，观察细胞生长情况，每2 d传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。

2.2CSE制备CSE的制备参考Baginski等[7]报道的方法并加以修改。收集3支实验研究用的滤嘴香烟(3R4F标准香烟，每支焦油含量9.5 mg，尼古丁含量0.73 g)，用50 mL针筒抽吸入30 mL PBS中。香烟持续抽吸4 min。1支香烟抽吸完毕后，溶液用1 mol·L-1氢氧化钠(市售分析纯)调整pH值至7.2～7.4，然后经含0.45 μm微孔滤膜的滤头过滤除菌，在320 nm检测吸光度定标。CSE在-80℃保存，使用前应快速解冻，30 min内用于实验。

2.3Q-PCR检测TGF-β1的表达取指数生长期的A549细胞制成单细胞悬液，以2×105个/瓶的密度接种于12.5 mL培养瓶中，待细胞覆盖培养瓶80%以上，用PBS洗1次，彻底去除血清作用，换用0.1% BSA的DMEM培养基继续培养过夜。药物孵育 48 h后，提取细胞的mRNA，以逆转录的cDNA为模板，以GAPDH 上游序列:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游序列:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′作为内参；用目的基因TGF-β1引物上游序列: 5′-CCAGGACGCCTTCTGCAAC-3′，下游序列: 5′-CCTCCTTTACCAGCTTCTTCCC-3′进行荧光定量PCR分析。

2.4酶联免疫吸附法(ELISA)检测A549细胞接种于12孔板，每孔培养基总量1 mL, 各组细胞于加药刺激后留取细胞培养上清，分别用于检测TGF-β1的蛋白表达。ELISA检测细胞上清液中TGF-β1的蛋白含量，操作步骤按试剂盒说明书进行。

2.5免疫荧光染色A549细胞接种在盖玻片上，放入12孔板中培养，各组细胞于加药刺激后PBS洗3遍，弃PBS后加入4%多聚甲醛固定0.5 h。然后用0.1% (V/V) Triton X-100/PBS通透0.5 h， 1% BSA (W/V)/1% 正常血清(V/V)/PBS在常温下封闭1 h。弃封闭液，孵一抗(1 ∶50，PBS稀释)，4℃冰箱放置过夜，洗片，然后用荧光二抗(1 ∶200，PBS稀释)在常温下孵育2 h。洗片后DAPI染核。用50%甘油进行封片，于共聚焦显微镜下观察染色情况。

2.6Westernblot检测将对数生长期的细胞，每孔106个接种于6孔板，药物预处理0.5 h，加CSE刺激0.5 h后，收集细胞，裂解液裂解细胞，4℃、12 000 r·min-1离心10 min，获得蛋白样品。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白变性后，30～50 ng蛋白样品上样，十二烷基硫酸钠凝胶电泳2 h，湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗(1 ∶500)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗(1 ∶5 000 HRP标记的羊抗兔IgG)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，以Odyssey荧光扫描仪扫描，采用Quantity one软件计算灰度比值。

2.7细胞Shp2基因转染A549细胞培养于6孔板中，生长24 h后，根据说明书用Lipofectamine 2000试剂将携带Shp2 siRNA 序列(正义链5′-GAACAUCACGGCAAUUAAUU-3′，反义链5′-GAACACUGGUGAUUACUAUUU-3′)和空载体转入到A549细胞中。转染48 h后，用免疫印迹法检测细胞中Shp2蛋白表达。

3 结果

3.1CSE对Shp2表达及活性的影响为确定CSE对肺上皮细胞Shp2表达的影响，Ⅱ型肺泡上皮细胞A549在2% CSE培养液中培养6 h，Western blot结果显示，与未处理空白组相比，CSE刺激组Shp2明显过表达(Fig 1A)。CSE刺激A549细胞15 min后, Western blot法测定Shp2磷酸化水平，如Fig 1B显示，CSE呈浓度依赖性诱导A549细胞Shp2磷酸化。

3.2PHPS1对CSE诱导的TGF-β1表达的影响PHPS1(20 μmol·L-1)预处理细胞0.5 h后，加2% CSE刺激细胞48 h后，采用Q-PCR和ELISA法测定TGF-β1 mRNA和蛋白的表达。Fig 2结果显示，PHPS1抑制CSE诱导的TGF-β1 mRNA和蛋白的表达。

3.3PHPS1对CSE诱导的肺上皮细胞形态的影响采用显微镜观察PHPS1对CSE诱导的肺上皮细胞形态的影响。结果显示，与空白对照组相比(Fig 3A)，CSE刺激A549细胞48 h后，细胞的形态发生改变 (Fig 3B)。在加CSE刺激之前，PHPS1 (20 μmol·L-1)预处理30 min，能改善CSE诱导的细胞形态改变(Fig 3C)。而PHPS1 (20 μmol·L-1)单独处理细胞对细胞的形态没有明显的影响 (Fig 3D)。

3.4PHPS1对CSE诱导的EMT的影响免疫荧光染色A549细胞，Fig 4结果表明，与空白对照组相比，2% CSE刺激组EMT相关因子E-cadherin表达(绿色荧光)减少，Vimentin和α-SMA表达增加；预先用PHPS1(20 μmol·L-1)处理能明显增加E-cadherin表达，减少Vimentin和α-SMA表达。该结果提示抑制Shp2能有效减少CSE诱导EMT相关因子的表达。

Fig 1 Stimulation of CSE increases Shp2 level and phosphorylation in A549 cells (±s, n=4)

*P<0.05vsuntreated control group

3.5Shp2抑制减少CSE诱导的Smad2活性PHPS1(20 μmol·L-1)抑制Shp2的活性，然后用2% CSE刺激细胞0.5 h，Western blot法检测Smad2的磷酸化。如Fig 5A所示，PHPS1明显抑制CSE诱导的Smad2的激活。进一步采用Shp2 siRNA抑制Shp2的表达，Fig 5B结果显示，阻断Shp2的表达可明显抑制CSE诱导的Smad2的磷酸化。

4 讨论

肺癌和COPD是常见病，在有些病人也是共患病[1]，晚期均有不同程度的肺纤维化[8]。肺纤维化发病机制较复杂，迄今为止尚未完全阐明。在COPD，EMT参与组织修复和重塑的过程会导致小气道纤维化；在肺癌，EMT除了促进肿瘤细胞的转移，也会引起肺纤维化[1]。

Fig 2 Inhibition of Shp2 reduces expression of TGF-β1 mRNA(A) and protein(B) induced by CSE in A549 cells(±s, n=4)

**P<0.01vsuntreated group;#P<0.05,##P<0.01vsCSE-stimulated group

Fig 3 Effect of PHPS1 on CSE-induced variation of cell morphology in A549 cells

A: Control; B: 2% CSE; C: 2% CSE + PHPS1; D: PHPS1

A: Representative photomicrographs demonstrating E-cadherin, Vimentin and α-SMA detected by immunofluorescence staining(scale bar: 200 μm). B:Fluorescent quantitative results.*P<0.05,**P<0.01vsuntreated group;#P<0.05vsCSE-stimulated cells.

Fig 5 Inhibition of Shp2 inhibitor(A) or Shp2 siRNA(B) alleviates Smad2 phosphorylation induced by CSE in A549 cells (±s, n=4)

Cell lysates were prepared, and then immunoblotted with antibodies for phospho-Smad2 phosphorylated at Ser465/467.*P<0.05vsuntreated group/negative control (NC) group;#P<0.05vs2% CSE group.

吸烟是引起肺纤维化的重要因素。机体吸入香烟烟雾之后将会改变其生理机制。Araya等[9]的研究发现，COPD患者的鳞状气道上皮细胞分泌的IL-1β可以促进气道成纤维细胞胶黏蛋白的表达，这主要是通过成纤维细胞αvβ8的过表达以及后续TGF-β的激活。因此，我们推测肺上皮细胞分泌的细胞因子和趋化因子可能会触发TGF-β的激活。

TGF-β1是调节EMT的一种重要信号元素，了解TGF-β1在EMT中的具体信号机制将有助于减轻纤维化，同时保留TGF-β1在体内重要的平衡功能[10]。Shp2有多种调节功能，如骨架重排、转录和细胞增生[11]。Shp2 正向调控成纤维细胞的黏附和迁移，Shp2纯合突变的成纤维细胞的伸展和迁移能力降低[12]。Shp2特异性抑制剂PHPS1可缓解吸烟引起的炎症反应，抑制多种肿瘤细胞的增殖，其简单的化学结构及较好的药效为临床治疗与Shp2相关疾病提供了新的手段[3]。近年来有文献报道称，阻断Shp2能抑制TGF-β1诱导的EMT[13]。在本实验中，我们发现用CSE刺激肺泡上皮细胞可以激活Shp2, 促进TGF-β1的表达。进一步研究相关的机制，我们探索Shp2特异性抑制剂PHPS1是否能阻断TGF-β1的上调，从而抑制CSE诱导的EMT。本研究结果显示，PHPS1能抑制TGF-β1的上调，并且反转CSE刺激后EMT相关因子的变化。我们推测Shp2可能是众多EMT刺激剂的下游信号靶点。

正如以往报道的，EMT的形成依赖Smad信号途径的激活[14]。且已有研究证明，抑制Smad2的活性或表达可以明显抑制CSE诱导的EMT相关因子的表达变化[15]。本研究结果显示，用CSE刺激肺泡上皮细胞能激活Smad2信号通路。值得注意的是，抑制Shp2的活性或表达可抑制Smad2的激活。本研究发现，CSE诱导的EMT可能经过TGF-β1/Shp2/Smad2信号途径，为深入研究肺纤维化的发病机制奠定了基础。本研究初步探讨了Shp2对香烟诱导的EMT的调节作用，结果提示Shp2可能是治疗COPD和肺癌的一个新靶点。

(致谢：感谢国家食品药品监督管理局浙江呼吸药物研究实验室提供的实验条件和技术支持。)

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