纳豆芽孢菌剂对放养初期黑天鹅血液中IL-10和APRIL含量的影响

陈 斌 , 张占侠 , 孔佳佳 , 赵洪妹 , 刘伟娟 , 陈 叶 , 刘立贤 , 李勇军 , 董 超

(1.石家庄市动物园管理处 ， 河北 石家庄 050200 ； 2.武安市农牧局冶陶动物防疫监督站 ， 河北 邯郸 056300 ；3.河北省昌黎县农林畜牧水产局 ， 河北 秦皇岛 066600 ； 4.河北省科学院生物研究所 ， 河北 石家庄 050081)

纳豆芽孢菌剂对放养初期黑天鹅血液中IL-10和APRIL含量的影响

陈 斌1, 张占侠1, 孔佳佳2, 赵洪妹3, 刘伟娟1, 陈 叶1, 刘立贤1, 李勇军1, 董 超4

(1.石家庄市动物园管理处 ， 河北 石家庄 050200 ； 2.武安市农牧局冶陶动物防疫监督站 ， 河北 邯郸 056300 ；3.河北省昌黎县农林畜牧水产局 ， 河北 秦皇岛 066600 ； 4.河北省科学院生物研究所 ， 河北 石家庄 050081)

通过检测试验前后黑天鹅血清中白介素-10(IL-10)和增殖诱导配体(APRIL)含量，探讨纳豆芽孢菌剂对放养初期黑天鹅血液中细胞因子的影响。选取放养初期露天圈养的黑天鹅16只，随机分为对照组和试验组，对照组正常饲养，试验组在基础日粮中添加10%纳豆芽孢菌剂。记录体重和采食量变化，测定多个时间点血清中IL-10和APRIL含量。对照组黑天鹅体重和采食量均增加，试验前后血清中IL-10没有显著变化，APRIL先增高后下降；试验组黑天鹅体重增加，采食量下降，血清中IL-10降低，APRIL增高。表明黑天鹅在放养初期饲喂纳豆芽孢菌剂，能够增强动物体质，抑制IL-10分泌，促进APRIL分泌，主动提高免疫能力，减少病原入侵机体的机会，增强放养初期的黑天鹅抗病能力。

纳豆芽孢菌剂 ； 黑天鹅 ； 细胞因子 ； 白介素-10 ； 增殖诱导配体

动物园外放到人工湖的珍贵游禽，在外放初期容易患病，导致存活率较低。前期研究表明[1]，珍贵游禽在这个时期，饲喂纳豆芽孢菌剂，发病显著减少，外放入人工湖后6个月内未出现死亡。纳豆芽孢菌剂能够提高动物生产性能、抗病能力[2-3]和鱼的非特异性免疫[4]，但在野生动物免疫方面未见报道。本试验从细胞因子角度探索纳豆芽孢菌剂增强放养初期的黑天鹅抗病能力的作用机理。

1 材料与方法

1.1 试验动物和材料 黑天鹅：雁形目、鸭科、天鹅属。亚成年体，全部按规程进行免疫。纳豆芽孢菌剂：为纳豆芽孢杆菌发酵的全产物制剂，由河北省科学院生物研究所研制。活菌3×108/g，γ-多聚谷氨酸25 mg/g，纳豆激酶20 000 IU/g，纳豆蛋白肽30 mg/g，无机盐0.025 g/g，环糊精载体0.9 g/g。

1.2 试验设计 黑天鹅为16只，完全随机分为对照组和试验组，每组各8只，佩带编号脚环。进行5日预饲养，饲喂基础日粮并记录采食量，若采食量差异显著则进行重新分组，若两组采食量差异不显著则进入试验期。在试验期中，对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中添加10%纳豆芽孢菌剂。基础日粮成分详见表1。

表1 对照组和试验组日粮组成

1.3 饲养管理 黑天鹅由孵化室内转入人工湖湖心岛露天圈养，对照组和试验组分笼饲养。饲养期40 d，其中前5 d为预饲喂期，后35 d为试验期。

1.4 样本采集与指标测定

1.4.1 样本采集 对照组：饲喂基础日粮并记录采食量。试验组：在基础日粮中添加10%纳豆芽孢菌剂，记录采食量。两组在试验期第1、12、35天称重。在试验期第1、6、12、35天，于腿部内侧采取静脉血，完全凝血后，4 000 r/min离心5 min，分离血清，在-20 ℃保存。

1.4.2 指标测定 采用酶标仪(Thermo Scientific Multiskan GO, Thermo)测定血清中白介素10(IL-10)和增殖诱导配体(APRIL)含量。具体步骤按照试剂盒(IL-10试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，APRIL试剂盒，购自Cloud-Clone Corp.)按说明书操作。

1.5 统计与分析 采用SSPS统计软件进行独立样本t检验、配对样本t检验和单因素方差分析，Plt;0.05为差异显著，Plt;0.01为差异极显著，Pgt;0.05为差异不显著，数据以(均数±标准差)表示。

2 结果与分析

2.1 纳豆芽孢菌剂对黑天鹅采食和体重影响 选取预饲喂期5 d(预饲喂期)，试验期第1-5天(试验前期)，第11-15天(试验中期)，第31～35天(试验末期)的采食量进行比较。饲养期采食量变化趋势见表2，体重变化见表3。

由表2可知，对照组和试验组在预饲喂期和试验初期采食量差异不显著(Pgt;0.05)，所以分组合理，可以继续试验。试验末期，对照组高于试验组，差异极显著(Plt;0.01)。

试验所用黑天鹅处于成长期，通常认为动物随着成长，采食量和体重会逐步增加。对照组采食量从预饲喂期到试验末期，采食量逐步增加，试验末期采食量高于试验前期，差异极显著(Plt;0.01)。试验组采食量从预饲喂期到试验初期，采食量增加，从试验初期到试验末期采食量减少，差异显著(Plt;0.05)。

由表3可知，对照组和试验组体重均呈现增长趋势。试验各阶段两组间体重差异不显著(Pgt;0.05)，试验期第35天重于第1天，差异极显著(Plt;0.01)。

表2 采食量变化

注：不同小写英文字母表示同列组间差异显著(Plt;0.05)，不同大写英文字母表示同行组间差异显著(Plt;0.05)，肩标相同者表示差异不显著，下表同

表3 体重变化

2.2 纳豆芽孢菌剂对黑天鹅血液中IL-10和APRIL的影响 两组黑天鹅血液中IL-10的变化见表4，APRIL的变化见表5。

由表4可知，组间比较，试验期对照组与试验组第1天IL-10差异不显著(Pgt;0.05)。第6、12、35天，对照组低于试验组，差异极显著(Plt;0.01)。组内比较，试验期对照组各组间差异均不显著(Pgt;0.05)；试验组第35天IL-10低于第1天，差异极显著(Plt;0.01)；试验组第35天与第12天IL-10差异不显著(Pgt;0.05)。对照组IL-10在试验期中差异不显著(Pgt;0.05)。

由表5可知，组间比较，试验期对照组与试验组第1天APRIL差异不显著(Pgt;0.05)。第6、12、35天，对照组高于试验组，差异极显著(Plt;0.01)。组内比较，对照组第6天APRIL高于第1、12、35天，差异显著(Plt;0.05)；对照组第1、12、35天的APRIL差异不显著(Pgt;0.05)；试验组第35天APRIL高于第1天，差异极显著(Plt;0.01)；试验组第12天APRIL高于第1天，差异极显著(Plt;0.01)；试验组第35天APRIL与第12天差异不显著(Pgt;0.05)。对照组在试验第6天出现显著升高，在第12天又显著降低。

表4 黑天鹅血液中IL-10变化

表5 黑天鹅血液中APRIL变化

3 讨论

动物的免疫机能是抵御病原感染的主要力量，细胞因子在其中发挥重要作用[5]。黑天鹅在圈养期间接触病原机会较小，但是外放后接触其他禽类、采食非饲料食物等情况使得感染机会大增[6]，所以外放后6个月内是其患病和死亡的高峰期。在外放前的过渡饲养期内，提高黑天鹅的免疫机能可以减少外放后的发病率。

3.1 纳豆芽孢菌剂对放养初期黑天鹅采食和体重的影响及分析 预饲喂期和试验初期，两组间没有显著差异，说明试验动物分配均匀合理，体质相当。试验所用黑天鹅处于成长期，通常认为动物随着成长，体重和采食量会逐步增加。对照组的体重和采食量符合这个情况，且试验末期体重和采食量呈现显著增加。试验组出现了不同情况。试验组体重随着成长逐步增加，但是采食量却逐步减少，试验末期体重显著增加，采食量显著减少。试验组并没有因采食减少而导致生长放缓。说明添加纳豆芽孢菌剂后黑天鹅对饲料的吸收和利用度显著增加。试验组黑天鹅体重逐步增加，且与对照组没有显著差异，但是组内个体的整齐度要优于对照组。试验末期，对照组内个体体重差异比较明显，体重更大的个体对于体重较轻的个体具有采食和行动的优先权。体重轻的个体在外放后，争取不到足够的食物和空间，而被淘汰。添加纳豆芽孢菌剂后，有利于黑天鹅外放后减少甚至避免个体竞争导致的死亡。

3.2 纳豆芽孢菌剂对放养初期黑天鹅血液中IL-10和APRIL的影响 细胞因子是细胞受病菌、病毒刺激而释放发出来的一大类活性物质，它能激活并调节免疫应答，对抗微生物入侵。IL-10属于Th2型细胞因子，主要能够抑制和消除炎性反应，介导体液免疫应答。APRIL属于Th1型细胞因子，为TNF家族成员，具有增强机体抵抗病原入侵的作用，在正常组织中低表达，受到抗原刺激后强表达。本试验中试验期内，对照组IL-10没有显著变化；APRIL在第6天出现升高，而后下降并稳定在试验初期的水平。这可能是动物在外界受到抗原刺激，但刺激不强且不持续，所以引起短时间的升高，刺激消失后，逐步下降。试验组中，IL-10在第6天开始显著下降，并于第12天后稳定不再显著下降；APRIL在第6天开始显著上升，于第12天后稳定不再显著上升。这说明饲喂纳豆芽孢菌剂后，IL-10分泌被抑制，APRIL分泌则被激活，并于第12天达到新的稳定状态。有研究显示[7]，体外细胞试验中，纳豆芽孢杆菌能够起到大肠杆菌、沙门菌同样的抗原刺激作用，刺激体外细胞大量分泌APRIL，并抑制IL-10的分泌，但不会像病原菌那样损伤细胞。本试验证明，纳豆芽孢杆菌在黑天鹅体内也有同样的作用。APRIL分泌增加，增强机体对抗病原入侵能力，IL-10分泌受到抑制，能够增强APRIL的促炎作用，这就使得动物在未接触病原前就激活免疫系统，减少病原入侵机体的机会，这与临床应用的效果相吻合。

4 结论

通过前期研究[1]和临床经验，我们认为在外放过渡时期，动物处于亚健康状态[6]。由于从兽舍内过渡到露天环境，体质和免疫力被削弱，但是由于还在圈养条件下，相对完全散养的动物，受到饲养员较好的照顾，未接触外界过多的病原，不容易被病原感染。动物处于一个弱的免疫平衡状态。饲喂纳豆芽孢菌剂后不仅消化吸收能力和体质得到增强，而且受到纳豆芽孢杆菌的刺激，促进Th1型细胞因子APRIL分泌，抑制Th2型细胞因子IL-10分泌，主动提高免疫能力，减少病原入侵机体的机会，增强放养初期的黑天鹅抗病能力。

[1] 陈斌,刘立贤，张占侠，等.纳豆芽孢菌剂消除小天鹅转群应激的研究[J].安徽农业科学，2016,44(25)：122-123.

[2] 孙妍,王加启,奚晓琦,等.纳豆芽孢杆菌在反刍动物生产中的应用[J].中国畜牧兽医，2009,36(7):21-25.

[3] 王星,覃宗华,谢明权,等.纳豆芽孢杆菌对黄羽肉鸡生产性能和免疫功能的影响[J].中国家禽,2007,29(22):20-23.

[4] 周国勤，杜宣，吴伟．纳豆芽孢杆菌对鱼类非特异性免疫功能的影响[J]．水利渔业，2006，26(1)：101-103.

[5] 王世若,王兴龙,韩文瑜.现代动物免疫学[M].长春：吉林科学技术出版社,1996:172-184.

[6] 王万华,王志永,李勇军,等.动物园动物的应激及其管理[J].野生动物杂志,2009,30(6):318-320.

[7] 尚沁沁，黄琴，徐歆，等。纳豆芽孢杆菌B4对Caco-2细胞活性、黏附与细胞因子分泌的影响[J]。动物营养学报，2014，26(1)：279-286.

EffectofBacillusSubtilisNattoonIL-10andAPRILatEarlyStockingstageofBlackSwans

CHEN Bin1, ZHANG Zhan-xia1, KONG Jia-jia2, ZHAO Hong-mei3, LIU Wei-juan1, CHEN Ye1, LIU Li-xian1, LI Yong-jun1, DONG Chao4

(1.Shijiazhuang Zoo,Shijiazhuang 050200,China;2.Wu’an Agriculture and Animal Husbandry Bureau,Handan 056300,China;3.Changli Animal Husbandry Bureau,Qinghuangdao 066600,China;4. Institute of Biology, Hebei Academy of Sciences, Shijiazhuang 050081,China)

By detecting the levels of IL-10 and APRIL in the serum of Black Swans, the effect of soybean sprout inoculum on the cytokines in the blood of Black Swans at early stage was studied.Black Swans in the early stage of rearing were randomly divided into two groups: control group and experimental group. The control group was normal feeding, and the experimental group added 10% Bacillus Natto inoculum in the basal diet. The changes of body weight and feed intake were recorded, and the contents of IL-10 and APRIL in serum were determined at different time points. The control group of Black Swans, body weight and feed intake were increased, serum IL-10 did not change significantly, and APRIL was increased first and then decreased. In the experimental group Black Swans, weight gain, feed intake, and serum IL-10 were decreased, but APRIL was increased.In the early stage of the Black Swans feeding, the soybean sprouts spore bacteria can enhance the animal's physique, regulate the cytokine, and improve the ability of the animals to resist the invasion of pathogens.

BacillusSubtilisNatto; Black Swans ; Cytokines ; IL-10 ; APRIL

S858

A

0529-6005(2017)10-0042-03

2017-07-10

石家庄市科学技术研究与发展计划(161500182A)

陈斌(1980-)，男，兽医师，硕士，从事野生动物疾病预防与治疗工作，E-mail: 49343147@qq.com