五味子乙素抗肾纤维化作用及机制研究*

郑海洲，张杰，肖程程，秦聪，徐涛

（武汉大学人民医院 泌尿外科，湖北 武汉 430060）

五味子乙素抗肾纤维化作用及机制研究*

郑海洲，张杰，肖程程，秦聪，徐涛

（武汉大学人民医院 泌尿外科，湖北 武汉 430060）

目的探讨五味子乙素对肾纤维化的改善作用及其机制。方法以分别不同剂量的五味子乙素给缺血再灌注（I/R）模型小鼠灌胃。通过Masson染色对各组小鼠肾纤维化进行评价，免疫组织化学染色检测各组小鼠肾组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）的表达；Western blot法检测各组小鼠肾组织α-SMA、CollagenⅠ、上皮性钙粘蛋白（E-cadherin）、转化生长因子β1（TGF-β1）和p-Smad3的表达水平。结果Masson染色结果显示，五味子乙素治疗组较I/R组小鼠肾间质纤维化及小管萎缩减轻；免疫组织化学染色结果显示，治疗组较I/R组α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达减少；Western blot检测结果显示，治疗组较I/R组E-cadherin表达增高，α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β1和p-Smad3表达均下降，且呈现出剂量效应。结论五味子乙素具有抗肾纤维化的作用，其机制可能与抑制TGF-β/Smad信号通路有关，提示五味子乙素有望成为抗肾纤维化的临床治疗药物。

肾纤维化；五味子乙素；缺血再灌注；治疗

慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）全球患病率为8%～16%，已成为全球性公共卫生问题[1]。研究表明，超过60%的急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）患者会逐渐发展为 CKD，CKD 患者更易发生AKI，AKI也会加速CKD进程[2-3]。肾间质纤维化是各种CKD发展为终末期肾衰竭的共同途径[4]。因此，治疗肾间质纤维化是预防与治疗慢性肾脏疾病的关键。

肾小管上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肾间质纤维化发生、发展的重要机制，EMT是指肾小管上皮细胞的表型发生改变，丧失上皮细胞表型，获得间质细胞特征[5]。大量研究表明，转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）是最主要的促纤维化因子，五味子乙素能通过抑制TGF-β1信号通路发挥抗血管纤维化作用[6]，五味子乙素还可减轻四氯化碳引起的肝细胞损伤，对缺血再灌注引起的心肌细胞损伤也有一定的保护作用[7]。五味子乙素对肾纤维化是否具有保护作用，目前尚无文献报道。本实验通过小鼠体内研究，探索五味子乙素对肾脏纤维化的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与动物

20只健康雄性C57BL/6小鼠（购自武汉大学医学院动物实验中心，动物号：S0271605051A），体重20～25 g。五味子乙素（购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度＞98%），兔抗小鼠GAPDH、α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）、上皮性钙粘蛋白（E-cadherin）、Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ）、转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）和 p-Smad3 抗体（购自美国 Abcam公司），Masson染色试剂盒、DAB试剂盒、橄榄油、十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒、Marker和BCA蛋白定量试剂盒（购自湖北省武汉谷歌公司），微量移液器（购自德国Eppendorf公司），离心机（购自德国Thermo公司），超级纯水仪（购于美国Millipore公司），显微镜（购自日本Olympus公司），Odyssey双色红外荧光成像系统（购自美国LI-COR公司）。

1.2 分组及复制I/R模型

20只小鼠随机分成4组：①假手术组（Sham）；②肾缺血再灌注模型组（I/R）；③低剂量治疗组（五味子乙素10 mg/kg灌胃）；④高剂量治疗组（五味子乙素20 mg/kg灌胃）；每组5只。小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻醉，常规消毒，于左侧肋缘下切开约1～1.5 cm，暴露左肾后仔细剔除肾蒂周围脂肪组织以暴露血管，用微血管钳夹闭血管25 min，以相同操作夹闭右侧血管25min（右侧切口比左侧低约0.5 cm），血管夹闭1～2 min后可观察到肾外观逐渐由红色变为深紫色。切口逐层缝合，75%酒精消毒后将小鼠置于恒温孵化器中。Sham组仅剥离脂肪组织，不夹闭血管。治疗组手术当天即开始给予药物灌胃，持续15 d；Sham组及I/R组给予等量的橄榄油（10 ml/kg）灌胃 15 d。

1.3 取材

在I/R模型小鼠术后10周，戊巴比妥钠腹腔麻醉后取小鼠左肾，颈椎脱臼处死小鼠。部分肾组织加4%的多聚甲醛固定以作病理分析，另一部分置于-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.4 观察各组肾组织纤维化程度

将4%多聚甲醛固定的肾组织石蜡包埋，切成4μm切片行Masson染色，显微镜下观察，高倍视野下（×400），Masson染色胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，蓝染的间质胶原纤维越多，表示肾纤维化越严重。Image-ProPlus 6.0分析蓝染区域所占面积比，实验结果用阳性面积百分率（Per Area Obj/Total）表示。

1.5 免疫组织化学染色检测各组肾组织α-SMA和CollagenⅠ的表达

组织切片，依次脱蜡、水化及抗原修复后，3%过氧化氢室温孵育15 min，正常山羊血清封闭30 min，分别滴加 α-SMA（1∶100），Collagen Ⅰ（1∶150），4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5 min。辣根过氧化物酶标记二抗室温下孵育10 min，PBS摇床漂洗，DAB染色后用蒸馏水冲洗2次终止反应，细胞核复染，梯度脱水后用中性树胶封片，显微镜下观察，高倍视野（×400）肾间质内可见棕黄色条索、波纹状染色为阳性表达。Image-Pro Plus 6.0分析α-SMA和CollagenⅠ阳性表达区域所占面积，实验结果用阳性面积百分率（Per AreaObj/Total）表示。

1.6 Western blot检测各组肾组织α-SMA、CollagenⅠ、E-cadherin、TGF-β1和p-Smad3的表达

将肾组织剪碎研磨，加蛋白裂解液提取细胞蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，提取的蛋白置于100℃恒温器变性10 min。每孔20 μg蛋白的上样量经SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室温下5%脱脂奶粉封闭1 h。TBST洗膜3次后放入相应的一抗中，4℃孵育过夜。次日取出，TBST清洗3次后放入二抗中，避光常温孵育1 h，利用Odysey双色红外激光成像系统扫膜。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五味子乙素减轻I/R小鼠模型肾损伤

Masson染色结果显示：Sham组肾小球，肾小管形态、大小均正常，肾间质仅肾小球系膜及基底膜、肾小管基底膜及脉管区有蓝色表达区域，未见纤维增生；I/R组术后10周，可见肾间质萎缩和坏死，间质大量炎症细胞浸润，蓝染区域较Sham组增多，肾间质纤维化严重；五味子乙素治疗组与I/R组比较，肾损伤程度减轻，胶原蓝染面积减少（见图1A）。各组胶原纤维阳性面积，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=201.584，P=0.000）。两两比较用LSD-t检验，I/R模型组较Sham组胶原纤维阳性面积增多（P=0.000）；治疗组与I/R组比较，胶原纤维阳性面积减少（均P=0.000）。见图1B。

2.2 五味子乙素调节I/R模型小鼠肾组织α-SMA和collagenⅠ的表达

各组小鼠肾组织α-SMA和CollagenⅠ的表达水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=90.850和 148.818，均P=0.000）。Sham 组肾组织α-SMA和CollagenⅠ表达较少，I/R组表达较Sham组增高（均P=0.000）。五味子乙素治疗组α-SMA和CollagenⅠ表达较I/R组均减少（均P=0.000），高剂量组治疗效果比低剂量组好。见图2。

图1 五味子乙素治疗I/R模型小鼠的肾组织染色结果 （Masson染色×400）

图2 五味子乙素调节I/R模型小鼠肾组织α-SMA和CollagenⅠ的表达 （免疫组织化学法×400）

2.3 各组小鼠肾组织 α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin的表达

术后10周，各组小鼠肾组织α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin蛋白相对表达水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=67.201、85.092及166.843，均P=0.000）。与Sham组比较，I/R组α-SMA和CollagenⅠ表达量增高（均P=0.000），与I/R组比较，治疗组α-SMA和CollagenⅠ表达量减少（均P=0.000），且高剂量治疗组表达量减少。上皮特征蛋白E-cadherin I/R组表达量较Sham组减少（P=0.000），治疗组表达量比I/R组增高（均P=0.000）。见图3。

图3 各组小鼠肾组织α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin的表达

图4 各组小鼠肾组织TGF-β1和p-Smad3的表达

2.4 各组小鼠肾组织TGF-β1、p-Smad3的表达

各组小鼠肾组织TGF-β1、p-Smad3蛋白相对表达水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=245.580和 175.083，均P=0.000）。Sham 组TGF-β1和p-Smad3无表达，I/R模型组表达较多（均P=0.000），治疗组较I/R组表达量减少（均P=0.000）。见图 4。

3 讨论

肾间质纤维化是慢性终末期肾病的主要病理变化，也是各种慢性肾病的最终结果[1，4]。IRI病理变化是急性肾小管凋亡和坏死，是AKI的主要原因。肾脏发生缺血损伤后其功能可恢复正常，但成纤维细胞大量增殖、细胞外基质过度沉积，导致肾小管间质纤维化，最终进展为CKD[8]。EMT是肾间质纤维化的一个重要因素，包括上皮标志物的缺失如E-cadherin以及间质指标的增多，如α-SMA和CollagenⅠ等[9]。虽然输尿管梗阻是建立小鼠肾纤维化模型的传统方式，但临床上由输尿管梗阻导致的肾纤维化发生率较低[10]，而缺血再灌注损伤与临床联系紧密，AKI与CKD的病理相关性最近也已明确澄清，AKI患者比有CKD病史的患者更容易发生终末期肾脏病[11]。小鼠肾缺血再灌注模型十分契合急性肾损伤发展为慢性肾损伤的过程[11-13]。

TGF-β1调节细胞生长、纤维化和炎症，在正常或损伤组织重塑中起着至关重要的作用，TGF-β1的异常调节常导致病理纤维化的细胞增殖和细胞外基质蛋白的过度积累[14-15]。TGF-β1是最重要的促肾纤维化因子，研究表明TGF-β1在激活下游Smad信号调节肾小管间质纤维化中起着重要作用，其机制可能是通过激活TGF-β/Smad信号途径实现[5]。本实验Western bolt结果显示，发生纤维化组织中TGF-β1和p-Smad3蛋白的表达量会明升高。

五味子乙素是中药五味子的主要活性成分，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎以及抗肿瘤作用，对心、脑、肝和肾等多种器官均具有保护作用[16]。五味子乙素通过靶向针对TGF-β1，对肿瘤、血管损伤和原发性肺动脉高压等均具有治疗作用[17-18]。LEE等[19]研究发现，五味子乙素还可抑制炎症和防止基质金属蛋白酶的降解，对大鼠大脑缺血再灌注引起的神经损伤也具有保护作用。本研究中，I/R组Masson染色可见蓝染的胶原纤维增多，间质炎症细胞浸润，肾间质结构严重破坏，肾小管明显萎缩和坏死；免疫组织化学染色及Western blot检测间质指标蛋白α-SMA和CollagenⅠ，I/R组表达较Sham组均升高，说明本实验通过I/R成功构造肾纤维化模型。用五味子乙素作为治疗药物逆转肾纤维化，从免疫组织化学及Western blot结果可以看出五味子乙素有治疗作用，五味子乙素通过抑制TGF-β1的表达，进而抑制p-Smad3的表达。

综上所述，在小鼠肾缺血再灌注损伤模型中，五味子乙素具有抗肾纤维化作用，其机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路，抑制细胞外基质堆积和上皮间质转化，从而减轻肾缺血再灌注损伤引起的肾小管间质纤维化，并提示五味子乙素有望成为抗肾纤维化的临床治疗药物，为肾纤维化的防治提供新的思路和途径。

[1]JHA V, GARCIA-GARCIA G, ISEKI K, et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives[J]. Lancet, 2013, 382(9888): 260-272.

[2]WEBSTER A C, NAGLER E V, MORTON R L, et al. Chronic kidney disease[J]. Lancet, 2017, 389(10075): 1238-1252.

[3]CHAWLA L S, EGGERS P W, STAR R A, et al. Acute kidney injury and chronic kidney disease as interconnected syndromes-NEJM[J]. New England Journal of Medicine. 2014, 371(1): 58-66.

[4]ZHANG L, WANG F, WANG L, et al. Prevalence of chronic kidney disease in China: a cross-sectional survey [J]. Lancet,2012, 379(9818): 815-822.

[5]CAREW R M, WANG B, KANTHARIDIS P. The role of EMT in renal fibrosis[J]. Cell Tissue Res, 2012, 347(1): 103-116.

[6]PARK E J, CHUN J N, KIM S H, et al. Schisandrin B suppresses TGF-beta 1 signaling by inhibiting Smad2/3 and MAPK pathways[J]. Biochem Pharmacol, 2012, 83(3): 378-384.

[7]闫荟羽,周微,曲晓宇,等.五味子乙素的药理研究进展[J].中国生化药物杂志,2014,34(2):153-156.

[8]INOUE T, UMEZAWA A, TAKENAKA T, et al. The contribution of epithelial-mesenchymal transition to renal fibrosis differs among kidney disease models[J]. Kidney Int, 2015, 87(1): 233-238.

[9]WANG L, CAO A L, CHI Y F, et al. You-gui pill ameliorates renal tubulointerstitial fibrosis via inhibition of TGF-beta/Smad signaling pathway[J]. J Ethnopharmacol, 2015, 169(3): 229-238.

[10]LIM B J, YANG H C, FOGO A B. Animal models of regression/progression of kidney disease[J]. Drug Discov Today Dis Models,2014(11): 45-51.

[11]CAMPBELL D, WEIR M R. Defining, treating, and understand-ing chronic kidney disease-a complex disorder[J]. J Clin Hypertens(Greenwich), 2015, 17(7): 514-527.

[12]SKRYPNYK N I, HARRIS R C, de CAESTECKER M P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice[J]. Journal of Visualized Experiments, 2013(78): e50495.

[13]NOGUEIRA A, PIRES M J, OLIVEIRA P A. Pathophysiological mechanisms of renal fibrosis: a review of animal models and therapeutic strategies[J]. In Vivo, 2017, 31(1): 1-22.

[14]SHAN G, ZHOU X J, XIA Y, et al. Astragalus membranaceus ameliorates renal interstitial fibrosis by inhibiting tubular epithelial-mesenchymal transition in vivo and in vitro[J]. Exp Ther Med, 2016, 11(5): 1611-1616.

[15]WANG Y, LE Y, XUE J Y, et al. Let-7d miRNA prevents TGF-beta 1-induced EMT and renal fibrogenesis through regulation of HMGA2 expression[J]. Biochem Biophys Res Commun,2016,479(4):676-682.

[16]LIU Z, ZHANG B, LIU K, et al. Schisandrin B attenuates cancer invasion and metastasis via inhibiting epithelial-mesenchymal transition[J]. PLoS One, 2012, 7(7): e40480.

[17]CHUN J N, KIM S Y, PARK E J, et al. Schisandrin B suppresses TGF-beta 1-induced stress fiber formation by inhibiting myosin light chain phosphorylation[J]. J Ethnopharmacol, 2014,152(2): 364-371.

[18]WU J, JIA J, LIU L, et al. Schisandrin B displays a protective role against primary pulmonary hypertension by targeting transforming growth factor beta 1[J]. J Am Soc Hypertens, 2017, 11(3):148-157.

[19]LEE T H, JUNG C H, LEE D H. Neuroprotective effects of schisandrin B against transient focal cerebral ischemia in sprague-dawley rats[J]. Food Chem Toxicol, 2012, 50(12): 4239-4245.

（王荣兵 编辑）

Protective effect of Schisandrin B on renal fibrosis and underlying mechanism*

Hai-zhou Zheng,Jie Zhang,Cheng-cheng Xiao,Cong Qin,Tao Xu
(Department of Urology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan,Hubei 430060,China)

ObjectiveTo investigate the protective of Schisandrin(Sch B)on renal fibrosis and underlying mechanism.MethodsMice were subjected to ischemia-reperfusion (I/R)injury in presence or absence of Sch B.Masson staining was performed for morphological grading of renal fibrosis.α-SMA and Collagen I expression in kidney tissue were determined by Immunohistochemistry.The expression levels of α-SMA,collagenⅠ,E-cadherin,transforming growth factor β1(TGF-β1)and p-Smad3 were measured by Western blot.ResultsRenal fibrosis and tubular atrophy were significantly alleviated by Sch B treatment when compared with I/R group.Immunohistochemistry staining showed that α-SMA and Collagen I in the I/R group increased significantly,which was attenuated by Sch B.Western blot suggested that,in the Sch B group,the expression of E-cadherin was increased while α-SMA,Collagen I,TGF-β1and p-Smad3 decreased dramatically in a dose dependent manner in comparison with those in the I/R group.ConclusionsData confirms that SchB can ameliorate renal fibrosis by inhibiting TGF-β/Smad signaling pathway,which could be a potential therapeutic intervention for renal fibrosis.

renal fibrosis;Schisandrin B;ischemia reperfusion

R692

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.001

1005-8982（2017）27-0001-06

2017-06-01

国家自然科学基金（No：81470923）

张杰，E-mail：zhangjiewhu666@163.com