高原地区不同品种公牛精液冻后活力与存活时间的试验比较

薛晓蓉，马元梅，胡宁玺，赵春川，金穗华

(1.青海省家畜改良中心，西宁 810016；2.南京农业大学，南京 210095)

高原地区不同品种公牛精液冻后活力与存活时间的试验比较

薛晓蓉1，马元梅1，胡宁玺1，赵春川1，金穗华2

(1.青海省家畜改良中心，西宁 810016；2.南京农业大学，南京 210095)

本研究对青海高寒地区6个品种公牛，共83头份细管冻精解冻后活力进行检测，并在室温（20～25℃）环境条件下保存，以精子活力变化程度评价精子的存活时间和存活力指数。结果表明：0h（解冻时镜检）、4h、8h、12h和14h的活力分别为39．0±3．8、35．7±4．9、30．3±5．5、22．5±5．5和14．6±4．9，活力下降幅度按照时间段分别为3．3、5．4、7．8、7．9个百分点，越往后期，幅度越大。按照品种统计分析：解冻后0h，安格斯牛、褐牛、牦牛、西门塔尔牛之间差异不显著，但均显著低于荷斯坦牛和柴达木黄牛（P＜0．05），4h时安格斯牛显著低于其他6个品种（P＜0．05）；8h时柴达木黄牛显著高于其他6个品种（P＜0．05）；12h时牦牛显著高于其他品种（P＜0．05）；14h时牦牛、柴达木黄牛显著高于其他6个品种。应用精子存活力指数综合评价，柴达木黄牛、牦牛、西门塔尔牛、荷斯坦牛、褐牛、安格斯牛分别为466．2、441．0、423．0、414．7、414．0、337．0。精液解冻后活力及保存过程中的活力变化之所以出现品种间的显著差异，遗传影响是重要因素。

公牛；品种；精子活力；存活时间；存活力指数

公牛精液主要质量要求所具有的生物学特性均与母牛受精率有着密切的关系[1]，其中“活力”常常被作为评价精液质量的首要指标。目前，在冷冻精液人工授精技术推广工作中，经常遇到精液解冻后不能立即输精的情况，此时则需要考虑到精子的保（生）存时间，特别是一些对外技术服务的农、牧区，由于使用的公牛品种较多，因此也涉及到品种间的差异问题。本试验旨在研究高寒地区不同品种公牛冷冻精液解冻后在常温状态下精子的存活能力，为人工授精技术的开展与研究提供基础资料。

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂

生物显微镜、恒温水浴箱、载玻片、玻璃指形管、玻璃小吸管、试管架。

1．2 样品来源

试验样品均为青海高寒地区饲养的种公牛采精后生产的冷冻精液，共6个品种83头份。其中牦牛、柴达木黄牛为本地品种，安格斯牛、荷斯坦牛、褐牛和西门塔尔牛为引进品种。

1．3 样品的检验与评定

样品解冻及检测，按照牛冷冻精液GB/4143-2008[2]中的操作要求进行。解冻后立即进行镜检作为0h检测结果。其余精液样品放置在常温环境（20～25℃）条件下保存，分为4个时间段，即4h、8h、12h、14h。样品检验人员均为能够熟练操作的技术人员，为了消除目测的误差，进行了内部人员之间、国内同类实验室之间的检验比对，以达到检验结果的一致性和可靠性。

对存活力指数，采取前后两次检查的平均评分和精液保存间隔所乘得的积的合计数字来表示[3]。

1．4 数据统计与分析

所有检验测定数据，均按保存时间和品种归类统计。采用SPSS软件对精子活力进行单因素方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2．1 不同品种公牛冷冻精液解冻后活力检测结果与分析

不同品种公牛冷冻精液解冻后活力检测结果，如表1所示。83头份公牛精液冻后活力均值为39.0±3.8。按照品种归类分析，安格斯牛、褐牛、牦牛、西门塔尔牛之间差异不显著（P＞0.05），但显著低于荷斯坦牛和柴达木黄牛（P＜0.05），其中柴达木黄牛活力最高，安格斯牛活力最低（P＜0.05）。

鉴于各品种公牛精液样本数的不同，应用变异系数对所得数值进行了评价，结果各品种公牛精液质量特性的检测数据，基本呈正态分布，表现了一定的稳定性和可靠性。

表1 不同品种公牛冷冻精液解冻后活力检测结果

2．2 不同保存时间的公牛精子活力比较与分析

表2所示， 83头份解冻后精液0、4、6、12、14h的精子活力分别为（39.0±3.8）%、（35.7±4.9）%、（30.3±5.5）%、（22.5±5.5）%、（14.6±4.9）%，随着保存时间的延长，精子活力表现显著下降势态(P＜0.05)，这与相关报道一致[4～6]。经对各时间段检测数据（活力均值、标准差、极小值和极大值）的分析，反映出试验数据离散程度较大，活力检测值并不集中，这其中最大影响因素可能与公牛遗传因素（品种间所表现的差异和不一致性）有关。

各时间段精子活力下降幅度，分别为3.3、5.4、7.8、7.9个百分点，越往后期，下降幅度越大，这个趋势符合精子生理代谢活动特征，即解冻后，随着保存时间的延长，精子能量被不断消耗，导致失去活力的精子数量不断增加。原因是由精子代谢而获得的能量大多数被用于了精子的活动力[3]。

表2 不同保存时间段精子的活力

2．3 不同品种公牛精子存活时间的比较

不同品种公牛精液解冻后精子存活时间见表3。在4h，安格斯牛显著低于其他5个品种牛（P＜0.05）。在8h，柴达木黄牛显著高于其他5个品种牛，而褐牛、荷斯坦、西门塔尔牛、牦牛之间差异不显著（P＞0.05），但仍然显著高于安格斯牛（P＜0.05）。在12h，牦牛已显著高于其他5个品种牛（P＜0.05）；而褐牛、荷斯坦牛、西门塔尔牛、柴达木黄牛均分别高于安格斯牛（P＜0.05）。在14h，牦牛仍然显著高于其他5个品种牛；而褐牛、荷斯坦牛、西门塔尔牛、柴达木黄牛之间差异不显著（P＞0.05），但分别显著高于安格斯牛（P＜0.05）。

表3 不同品种公牛精子存活时间的比较

图1 不同时间段各品种公牛精子活力的比较

从图1中可以看出，精子保存的5个时间段在图中已呈现自上而下的五条曲线，曲线上每个活力点对应着不同品种的公牛。在0h，柴达木黄牛活力处于最高点，安格斯处于最低点。当到12h和14h，两条曲线上显示的活力最高点是牦牛，其次为西门塔尔牛、荷斯坦牛、柴达木黄牛，安格斯牛始终最低。综上，以14h保存为最终观察结果，应用精子存活力指数计算方法，对各品种公牛解冻时活力、保存各时间段活力及活力下降幅度进行综合评价，结果由高至低分别为柴达木黄牛、牦牛、西门塔尔牛、荷斯坦牛、褐牛、安格斯牛。柴达木黄牛、牦牛精子存活力指数最为理想，其次为西门塔尔牛、荷斯坦牛、褐牛，安格斯牛最低。

3 讨论

3.1 近年来，牛冷冻精液解冻后的再保存已逐渐打破了解冻后即刻使用的界限和规范。因为，这是一些农牧区开展人工授精技术服务的需要，特别是一些人工授精站点，服务半径在几十公里内，精液解冻后前往输精点授精，不仅可以扩大服务范围，而且还可以提高液氮容器及液氮的利用率，节约了相应的费用。

3.2 影响精子在体外存活的因素诸多，本试验群体公牛均是同样饲养环境，同样的冻精生产工艺和同样的试验条件，精液解冻后活力及保存过程中的活力变化之所以出现品种间差异，无疑是受到遗传因素影响。据有关报道，同样的饲养环境条件下，公牛原精液活力和冷冻后活力，品种间存在明显差异(P＜0.05)[7]。相关研究认为，影响种公牛精液品质诸因素中包括遗传因素、种间差异和个体差异[8]。

3.3 不管是保存时间中表现的活力，还是精子存活力指数的评价，可以看出牦牛、柴达木黄牛始终保持着强势，特别是牦牛在14h仍保持在18%，显著高于其他各品种牛。以适者生存的观点，可以认为，牦牛和柴达木黄牛作为地方品种牛，常年生活在高寒地区，长期风土驯化已对高原的生态环境条件产生了良好的适应性；其公牛精子（细胞）在生存能力上表现出较强的适应性。因为，牦牛作为一个独特的生态类群为了适应其独特的生态环境和遗传演化，从而形成了特殊的遗传特性[9]。安格斯牛是引进的肉牛品种，对于饲养环境条件的要求相对高于其他品种牛，所以，在高寒地区所表现的适应性受到一定影响。

3.4 本文认为，正常情况下，精液解冻后在常温环境（20～25℃）条件下，保存至4h精子活力下降幅度最小，可作为安全保存时间段。如果保存温度接近体温，精子在体外仅能生活几小时，这是因为代谢基质消耗加快，导致乳酸积累、pH值下降，使精子发生衰老变化[10]。如果保存温度过低，则可能造成精子冷休克。

[1]秦和春,金穗华．牛精液质量与受精率的关系[J]．畜牧与兽医,2007,39(4):29-30．

[2]牛冷冻精液GB4143-84[S]． 北京:中华人民共和国标准化委员会．

[3]谢成侠． 家畜繁殖原理及其应用[M]． 第二版．南京:江苏科学技术出版社,1993．

[4]孙光华,唐骏,田传春,等． 提高西门塔尔牛冷冻精液使用效果的研究[J]．中国农学通报,2010,26(14):31-33．

[5]管艺,张红丽,马国锋．牛冷冻精液解冻后有效活力存放时间试验报告[J]．黄牛杂志,1995,4:18-19．

[6]张宝良,马玉婷,孔伟,等．牛细管冻精解冻后常温保存对受胎率的影响试验[J]．中国牛业科学,2015,41(2):41-44．

[7]刘绍贵,欧阳晓芳．不同品种种公牛繁殖性能分析[J]． 中国牛业科学,2010,36(4):19-21．

[8]周国权,徐敬哲,赵高俊,等．影响种公牛精液品质的因素[J]．现代畜牧兽医,2012,4:29-31．

[9]郎侠,杨博辉．牦牛的环境生理特征[J]．家畜生态学报,2004,25(40):103-104．

[10]E．S．F．哈弗士．农畜繁殖学[M]．上海:上海人民出版社,1977．

The Comparison Test on Motility of Frozen Semen for Different Breed Bulls in Plateau Region

XUE Xiao-rong1, MA Yuan-mei1, HU Ning-xi1, ZHAO Chun-chuan1, JIN Sui-hua2
(1.Animal Improvement Center of Qinghai Province, Xining 810016; 2.Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)

In this study, the motility of 83 frozen bovine semen samples of six breeds in Qinghai alpine region was tested. The survival time and vigor index of frozen semen was evaluated by the change of sperm motility at room temperature (20～25℃). The results showed that the motility was 39.0±3.8, 35.7±4.9, 30.3±5.5, 22.5±5.5 and 14.6±4.9 at 0, 4, 8, 12 and 14 hours, respectively. The amount of motility decline range was 3.3, 5.4, 7.8 and 7.9 percent point in the period of time. The later, the decline range was greater. According to the variety statistics and analysis, there was no significant difference in 0 hour between Angus, Brown cattle, Yak and Simmental, but they were significantly lower than Holstein and Qaidam cattle (P＜0.05). In 4 hours Angus was significantly lower than the other six breeds (P＜0.05). In 8-hour Qaidam cattle was significantly higher than the others (P＜0.05). In 12-hour Yak was significantly higher than the others (P＜0.05). In 14-hour Yak and Qaidam cattle were significantly higher than the others. The sperm vigor index of Qaidam cattle, Yaks, Simmental, Holstein, Brown cow, Angus were 466.2,441.0, 423.0, 414.7, 414.0, 337.0, respectively. The motility of different breeds and different preservation time semen is different. It is influenced by genetic factors.

Bull; Breeds; Sperm motility; Survival time; Vigor index

S823.3

A

1004-4264（2017）11-0017-03

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.11.005

2017-01-17

青海主要放牧家畜冻精生产技术研究与示范项目。

薛晓蓉（1963-），女，汉族，高级畜牧师，主要从事家畜繁殖与牛冻精生产技术等方面的研究工作。