黄土高原新造耕地1—氨基环丙烷—1—羧酸脱氨酶（ACCD）活性菌株的筛选及其功能特性

贾凤安　甄丽莎　常帆　吕睿+刘晨

摘要：为了筛选性能良好的新造耕地产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase，简称ACCD）菌株，对菌株进行多项分类鉴定，分离所产生的ACCD菌株并对其性质进行研究。以 1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）作为唯一氮源分离纯化普鲁兰酶产生菌，通过形态学鉴定、16S rRNA序列分析等试验确定菌株的分类地位。通过Biolog自动微生物鉴定系统，使用GenⅢ鉴定板进行生理生化测定，以及不同条件下酶活性的检测，研究菌株的产酶特性。通过平皿促生试验，研究菌株不同组分的促生作用。结果表明，从陕北新造耕地样品中分离得到6株ACCD产生菌，经过多项分类鉴定显示，这些菌株主要分为假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、伯克氏菌属（Burkholderia），其中Enterobacter菌株YAnl_w2产酶迅速，在最适温度和pH值条件下ACCD活性达0.54 μmol/（mg·h）（以单位质量酶蛋白在单位时间内生成α-丁酮酸的物质的量表示）。促生试验表明，YAnl_w2对麦种具有明显的促生作用，具有促生应用前景。对6株新造耕地分離菌株的多项分类结果鉴定发现，它们均为产ACCD的细菌，其中YAnl_w2菌株ACCD产率、产量较其他来源的酶高，对麦种促生作用明显，具有进一步的研究价值。

关键词：1-氨基环丙烷-1-羧酸；ACC脱氨酶；新造耕地；根际促生菌；肠杆菌属

中图分类号： S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0289-05

收稿日期：2016-05-23

基金项目：陕西省科学院科技计划青年人才项目（编号：2015K-21）；陕西省科学院青年联合创新项目（编号：2016k-18）；陕西省社会发展科技攻关项目（编号：2016SF-450）。

作者简介：贾凤安（1985—），女，陕西西安人，硕士，研究实习员，主要从事微生物肥料及微生物代谢产物相关研究。Tel：（029）85350847；E-mail：jiafengan@hotmail.com。

通信作者：甄丽莎，博士，助理研究员，主要从事微生物肥料及石油污染土壤修复相关研究。E-mail：zhenlisha2002@163.com。 黄土高原是全国水土流失较严重的地区之一，自退耕还林还草工程实施以来，黄土高原的植被覆盖度大幅提高，生态环境逐步改善。但是在退耕还林还草工程取得巨大成就的同时，黄土高原地区退耕土地面积已经超出可退耕面积的上限，导致耕地面积减少[1]，农民口粮难以保障[2]。为有效保障地方粮食生产，巩固退耕还林草的成效，达到耕地占补平衡的政策目标[3]，陕西省延安市率先开展治沟造地整治工程，以期扩大区域内可耕地的面积。而由治沟造地方式产生的新造耕地，土壤结构已被破坏，肥力低下，难以形成高标准农田，成为制约产量的关键性因素[4]。

土地土壤的生物指标、化学指标及其物理指标的退化是导致土地土壤质量退化最直接的表现。在逆境条件下，作物会持续产生高浓度的乙烯，对自身的生长造成阻碍。为了减缓这一阻碍效果，需要降低作物体内逆境乙烯的产生量。乙烯生物合成途径中的前体物质1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，简称ACC）可在ACC脱氨酶（ACC deaminase，简称ACCD）的作用下被分解为α-丁酮酸（α-KA）和氨[5]。而直接产生ACCD的植物细胞还未见报道[6]。植物根际促生细菌（plant growth-promoting rhizobacteria，简称PGPR）是一类游离在土壤或共生于植物根系的可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，同时能抑制有害生物的有益菌群[7]。许多PGPR可诱导产生ACCD，因此，具有ACCD活性的PGPR菌株在促进植株养分吸收[8]、增加生物量[9]、促进豆科植物结瘤[10]，以及保护植物免受盐碱[11]、干旱、真菌及细菌等致病菌[12]对生长产生的抑制作用方面具有较好的应用前景。

目前，关于ACCD活性的PGPR菌株研究主要集中在对自然土壤改良和增加肥效方面[13]，对人工干预土地中的原生PGPR鲜有报道。本研究通过对延安新造耕地、淤地坝等人工干预土地中PGPR菌株筛选、酶活性和促生效果的初步研究，以期寻找具有潜在促生作用的菌株，为延安人造土地提供原生菌种资源，为植物-微生物联合改良土壤研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

样品来源：样品采自陕西省延安市安塞县南沟村新造耕地表层下15～20 cm的土壤样本。采用“S”形采样法，每个采样地采集20个点，混合土样采用四分法处理保留约500 g，4 ℃冰盒保存运输。

1.2 培养基

PAF培养基（富集培养基）：10 g/L蛋白胨，10 g/L酪蛋白水解物，1.5 g/L MgSO4，1.5 g/L K2HPO4，10 mL甘油，pH值7.2。

DF培养基（筛选培养基）：组分（1），含10 mg H3BO3，112 mg MnSO4·H2O，124.6 mg ZnSO4·7H2O，78.2 mg CuSO4·5H2O，10 mg MnO3，将以上成分溶解于100 mL无菌水中，4 ℃保存；组分（2），含100 mg FeSO4·7H2O，将其溶于10 mL无菌水中，4 ℃保存。各取0.1 mL组分（1）与组分（2）溶液，再加入4.0 g/L KH2PO4、6.0 g/L Na2HPO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、2.0 g/L葡萄糖、2.0 g/L葡萄糖酸钠、2.0 g/L柠檬酸、2.0 g/L （NH4）2SO4。分离纯化培养基：在DF培养基中添加20g琼脂。endprint

ADF培养基（加富培养基）：将ACC溶于超纯水，过滤灭菌，加入到不含（NH4）2SO4的灭菌DF培养基中，终浓度为30 mmol/L。

TSB培养基（保存培养基）：17 g/L胰蛋白胨，3 g/L大豆胨，5 g/L NaCl，2.5 g/L葡萄糖，2.5 g/L K2HPO4，pH值7.1。

1.3 主要试剂与仪器

ACC，购自Sigma公司；Taq酶及细菌DNA提取试剂盒，购自TaKaRa公司。Centrifuge 5804R高速冷冻离心机，购自Eppendorf公司；梯度PCR仪，购自Biometra公司；Synergy H1多功能酶标仪，购自BioTek公司；Gen Ⅲ Microstation自动微生物鉴定系统，购自Biolog公司。

1.4 新造土壤中ACCD细菌的富集和分离

采用Penrose等的方法[14]并有所改进。称取延安新造耕地土壤样品各5 g，分别加入50 mL无菌水中，振荡制成土壤悬浮液，吸取1 mL悬浮液加入50 mL PAF培养液中，28 ℃、200 r/min振荡培养。24 h后，从其中吸取1 mL菌悬液重复转接1次。从第2次菌懸液中转移1 mL至50 mL DF培养液中，在相同条件下培养24 h后，从中吸取1 mL菌悬液加入 50 mL ADF培养液中，在相同条件下培养24 h，用于具有ACC脱氨酶活性细菌的筛选。梯度稀释ADF培养液中的菌悬液，并涂布于ADF固体平板上，在28 ℃恒温箱中培养，待长出单菌落后，挑取单菌落纯化后保存于TSB斜面培养基上。

1.5 ACCD促生活性菌的筛选与鉴定

1.5.1 菌株产ACCD活性测定 采用Penrose等的方法[14]并有所改进。（1）将-80 ℃冻存管中保存的菌种接入5 mL TSB液体培养基，扩大培养24 h后，4 ℃、9 000 r/min离心 10 min，弃上清，收集菌体。用不含（NH4）2SO4的DF液体培养基离心洗涤菌体2次，重悬于7.5 mL ADF培养基中，28 ℃培养24 h以诱导其产ACCD，4 ℃、9 000 r/min离心10 min，弃上清，收集菌体并记录菌体质量。（2）将菌体重悬于 600 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH值8.5）中，加入 30 μL 甲苯，迅速振荡30 s，破碎细胞，4 ℃贮存，即为粗酶液。（3）取 200 μL 粗酶液放入1.5mL离心管中，加入20 μL 0.5 mol/L ACC混匀，于30 ℃水浴60min。随即加入1 mL 056 mol/L HCl终止反应，12 000 r/min离心5 min，取上清液。（4）每毫升上清液加入800 μL 0.56 mol/L HCl和 300 μL 0.2% 2，4-二硝基苯肼溶液（在2 mol/L HCl中溶解），30 ℃保温 30 min。加入2 mL 2 mol/L NaOH混匀，540 nm 处测定吸光度。（5）绘制α-丁酮酸标准曲线：配制10 mmol/L的α-丁酮酸，分别取0、10、20、40、60、80、100、120 μL 母液稀释液加入试管中，用0.1 mol/L Tris-HCl（pH值8.5）补足至1 mL，α-丁酮酸浓度范围为0.024～0.293 μmol/mL。按步骤（4）操作。ACC脱氨酶活性以反应体系中1 mg酶蛋白1 h内生成α-丁酮酸的物质的量表示，单位为μmol/（mg·h）。

1.5.2 新造土壤细菌多项分类鉴定及系统发育分析 （1）生理生化鉴定：参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（8版）[15]。（2）16S rRNA序列扩增和序列分析：菌株在LB培养基中于28 ℃振荡培养至对数期，离心收集菌体，用TaKaRa试剂盒提取DNA。根据原核生物16S rRNA保守序列通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACC TTGTTACGACTT-3′）[16]进行16S rRNA的PCR扩增，采用50 μL反应体系，扩增程序：95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 35 s，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃10 min。扩增产物由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测定的序列在GenBank中用BLAST在线软件与已知的16S rRNA序列进行同源性分析，利用DNASTAR（SeqMan）拼接序列，并手工适当校正。采用ClustX 2.1软件进行多序列比对。用Mega 7.0软件包中的Kimura 2-Parameter Distance模型进行多序列匹配排列，用邻接法（Neighbor-Joining Method）构建16S rRNA 基因系统发育树。（3）Biolog自动微生物鉴定：选择IF-A培养液，利用Biolog GEN Ⅲ细菌鉴定板对微生物进行94种表型测试，微生物在测试板上所显示出的表型指纹被用来在种的水平上鉴定该微生物。

1.6 菌株产ACCD的培养条件研究

（1）温度对酶活性的影响：制得的粗酶液分别在温度为15～45 ℃条件下加入底物反应30 min，测定酶活性；（2）pH值对酶活性的影响：设置pH值范围为4.0～10.0的处理，分别用不同pH值的缓冲液配制底物和酶液，测定酶活性。

1.7 菌株促生作用研究

用饱和NaCl溶液选种，挑出饱满完整的麦种，用10%H2O2表面消毒5 min，蒸馏水漂洗4～5次晾干备用。以无菌水作为对照，分别用促生菌株菌体重悬液、发酵液、离心后的上清浸麦种24h，将不同处理的麦种置于装有湿润滤纸的无菌培养皿中，放入28 ℃光照培养箱内，定期观察种子萌发情况，5 d后测量麦种的根长、茎长，用以表征促生作用。

2 结果与分析

2.1 ACC脱氨酶活性菌株筛选endprint

采样地地理信息：36°35′N，109°17′E，海拔1 212 m；采样点YA-1种植玉米，为1年新造耕地混合土样；采样点YA-2种植白菜，为平整1月新造耕地混合土样；采样点YA-3为淤地坝混合土样，种植樱桃。

利用ADF筛选培养基从3份混合土样中共分离到43株菌株，根据菌落颜色、形态、大小、长势等特征初步去重得到18株菌株。根据Penrose等以ACC脱氨酶酶活性不低于 20 nmol/（mg·h） 作为筛选指标，得到6株ACCD活性较高的菌株[14]。

6株菌在ADF培养基经5次传代后仍正常生长，表明它们有产ACCD的能力。从表1可以看出，6株菌的酶活性差异较大，其中YAnl_w2、YAnl_ty7、YAnl_011 ACCD活性分别为（0291±0.010）、（0.185±0.021）、（0.136±0.015） μmol/（mg·h），其中YAnl_w2酶活性最高。

2.2 菌株16S rRNA 基因序列的测定、Biolog细菌鉴定以及系统发育分析

从延安安塞南沟村新造耕地初步分离后经初步筛选，得到6株具有产ACCD活性的细菌，经DNA提取和16SrRNA基因序列扩增、测序，由图2可以看出，6株菌主要分为假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、伯克氏菌属（Burkholderia）。结果表明，南沟村新造耕地具ACCD活性细菌多样性并不丰富，本试验中只筛选到3属共6株产ACCD细菌。研究表明，假单胞菌属作为土壤常驻细菌在生物防治[17]、促生作用[18]方面有巨大潜力。而肠杆菌属是近年来发现的具有ACCD活性的促生菌[19]，同时可产生吲哚乙酸（IAA）、铁载体等物质[20]。此外，发现分泌ACCD的伯克氏菌属[21]对番茄[22]、小麦[23]、茶叶[24]等农作物均有促生作用。

经MEGA 7构建Neighbor-Joining系统进化树分析（图2）以及在NCBI数据库、StrainInfo数据库中进行有效种16S rRNA基因序列相似性检索后发现，在假单胞菌属中，YAnl_w1 与Pseudomonas moraviensis strain CCM 7280 （AY970952.1）的相似性为98%，YAnl_011与斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）strain VKM B-975 （EU883663.1）的相似性为99%，YAnl_ty7与假单胞菌属（Pseudomonas sp.）C36 strain （AJ575816.1）的相似性为99%，但与栖稻假单胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）strain IAM 1568T （AM262973.1）的进化距离较远，还需要进一步确定其进化关系。肠杆菌属中，YAnl_w2与路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii）strain EN-119T （AJ853891.1）的序列相似性为99%，表明YAnl_w2属于肠杆菌属（Enterobacter）。伯克氏菌属YAnl_t2与Burkholderia gladioli pv. gladioli strain CFBP 2427 （GU936677.1）的相似性为98%，YAnl_ty5与Burkholderia caribiensis strain MWAP64 （Y17009.1）的序列相似性为100%，表明YAnl_t2和YAnl_ty5属于伯克霍尔德菌（Burkholderia）。

YAnl_w2对蔗糖、水苏糖、α-D-乳糖等多种寡糖，对D-山梨醇、D-甘露醇、肌醇等醇类，对D-丝氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸等氨基酸，以及对乳酸、柠檬酸、乙酸、L-苹果酸等短链酸呈阳性反应，其中能利用柠檬酸、乙酸为肠杆菌属（Enterobacter）典型反应[15]；Enterobacter属利用明胶速度慢[15]，亦表现为阴性反应。综上可知，YAnl_w2表现为典型的Enterobacter属特征。最终确定细菌的分类地位，仍需要通过各自形态特征、生理生化与化学分类特征及近缘菌株 DNA-DNA同源性结果来判断。

2.3 YAnl_w2性质及促生作用

2.3.1 YAnl_w2产酶条件初步研究 研究表明，肠杆菌属是一类产ACCD且具有促生潜力的细菌[25]，同时具有耐盐[26]、耐重金属[27]等优良特性，研究YAnl_w2菌株生长条件，对研究其酶学性质、优化产酶条件有重要意义。根据“2.1”节的试验结果，对酶活性最高、具有应用潜力的YAnl_w2菌产酶条件进行初步研究。

由图3-a可以看出，YAnl_w2细菌ACCD和底物反应时，温度和pH值的变化对ACCD活性影响较大。在温度较低（15 ℃）时，几乎没有酶活性，而随着温度的上升，酶活性逐渐升高，在30 ℃时，YAnl_w2酶活性最高，而随着温度继续上升，酶活性呈下降趋势，但37 ℃时ACCD活性仍约为最高酶活性的40%。

由图3-b可以看出，在30 ℃体系中，YAnl_w2的ACCD最适pH值为7.0[酶活性为0.54 μmol/（mg·h）]，pH值從4.0开始酶活性逐渐升高，pH值达到7.0后酶活性随着pH值的升高而逐渐下降。pH值在6.0～7.0之间时，YAnl_w2拥有较高的酶活性，表明YAnl_w2分泌的ACCD可能是一类中性酶。

2.3.2 YAnl_w2的促生作用 由图4可见，与无菌水浸种对比，YAnl_w2的各组分均有促生长作用，其中发酵液对麦种促生作用与CK相比，对麦种根长、茎长的促生作用显著，其次为菌体重悬液。菌体重悬液促生效果明显优于发酵液上清，说明细菌YAnl_w2通过附着在根系表面，可能在ACCD作用下吸收植物生成的ACC，从而达到促生效果；同时YAnl_w2可能还拥有其他促生因子。有报道指出，除产生ACCD外，肠杆菌可能还具有清除活性氧自由基等快速调节机制，从而对植株产生抗逆和促生的作用[28]，因此发酵液上清亦有促生效果，它对YAnl_w2的促生作用之后将进一步研究。endprint

3 结论

目前，人们对产ACCD的PGPR菌株已进行了大量报道。该菌株作为土壤改良剂、微生物活菌制剂等对土壤的改良正在成为土壤改良的研究热点[29-30]。具有ACCD活性的PGPR作用于其根际区域的生态位，利用与宿主植物的共生作用对环境胁迫条件作出响应[28，31]，同时通过风力、雨水等作用在地表和地下以游离形式运动，从而降低地区植株根际乙烯水平，减轻逆境胁迫环境对作物的不利影响[32]。

本研究以ACC为唯一氮源，采用富集定向筛选方法，从陕西延安新造耕地土壤中分离到6株具有ACC脱氨酶活性的植物促生菌，并测定了ACC脱氨酶活性，分析了16S rDNA 序列及其进化地位。本研究发现1株酶活最高、具有潜在应用价值的细菌YAnl_w2，研究发现该菌株可能产中温中性ACCD，酶活性最高可达0.54 μmol/（mg·h）；同时发现，YAnl_w2及其分泌的物质均对麦种产生促生效果，提示除ACCD外可能还有其他促生机制。YAnl_w2分离自延安地区新造耕地土壤，相较于其他来源的微生物制剂，对当地环境具有更好的适应性。今后，有待深入关于该菌株的促生作用以及相关微生物肥料的研究。

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