方格星虫提取物的 抗氧化活性及成分分析

,, ,,孙仁, , ,*,

(1.广西壮族自治区海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海 536000; 2.广西壮族自治区分析测试研究中心,广西南宁 530022; 3.广西科学院广西红树林研究中心,广西红树林保护与利用重点实验室,广西北海 536000)

方格星虫提取物的 抗氧化活性及成分分析

徐艳1,谢一兴2,邹杰1,李蕾藓3,孙仁杰3,王欣3,张琴1,*,聂振平1

(1.广西壮族自治区海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海 536000; 2.广西壮族自治区分析测试研究中心,广西南宁 530022; 3.广西科学院广西红树林研究中心,广西红树林保护与利用重点实验室,广西北海 536000)

目的:对方格星虫的抗氧化活性进行研究。方法:方格星虫匀浆后于室温下用乙醇提取,然后用乙酸乙酯和水萃取,得到不同极性的提取物,分别对提取物进行抗氧化检测,同时与合成的抗氧化剂抗坏血酸(VC)进行对照,并对有抗氧化活性的提取物进行化学成分分析。结果:实验结果表明水层提取物具有较好的抗氧化活性,乙酸乙酯层和乙醇提取物的抗氧化活性较弱;从乙酸乙酯层中分离鉴定出59个化合物,不饱和脂肪酸和甾体为主要成分;方格星虫水层具有多种成分,包括蛋白质、总糖、牛磺酸和SOD等。结论:不饱和脂肪酸、甾体、多肽、牛磺酸和SOD对方格星虫的抗氧化活性可能有一定的贡献。

方格星虫,抗氧化活性,气质联用,化学成分

方格星虫(SipunculusnudusLinnaeus)又称光裸星虫,俗称沙虫、土蒜、沙肠子、泥蒜等,隶属于星虫动物门(Sipuncula)方格星虫科(Sipunculida)方格星虫属(Sipunculus),在我国沿海均有分布,多数栖息在热带和亚热带浅海泥沙内和珊瑚间,以广西北部湾海区资源量最为丰富[1-2]。方格星虫不仅味道鲜美、营养丰富,药用价值也较高,有“冬虫夏草”之称[3-4]。

目前,国内外主要对其进行繁殖生物学、食用功效和药用价值的研究[5-7],方格星虫活性物质和生理活性研究表明,方格星虫中的主要活性成分为蛋白质、多糖、矿物质元素等,具有抗氧化、提高免疫力、抗辐射、抗病毒活性等多种生物学功能,方格星虫多糖和多肽的抗氧化活性已经有相关报道[8-10],但是关于方格星虫提取物的抗氧化活性研究还未见报道。本文,为综合开发方格星虫的药用和保健价值提供一定实验数据和理论数据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

方格星虫 2015年10月购自广西北海沙滩;DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 美国Sigma公司;柱层析硅胶及薄层层析硅胶板 青岛海洋化工厂;三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、铁氰酸钾、抗坏血酸(VC)、过氧化氢、邻苯三酚、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、蒽酮、茚三酮 国产分析纯试剂;无水乙醇、乙酸乙酯 为国产分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂。

1.2实验方法

1.2.1 方格星虫乙醇浸膏和各极性层的制备 鲜活方格星虫(14.5 kg)洗净,于组织捣碎机中绞碎,经95%的乙醇室温浸泡提取6次,每次30 min,过滤,合并提取液,减压浓缩后得乙醇浸膏。浸膏用水分散后,用等体积的乙酸乙酯萃取,减压浓缩后得到乙酸乙酯相(12.7 g)和水相(234.9 g)。称取乙醇浸膏、乙酸乙酯相和水相各1.000 g,置于具塞锥形瓶中,加入100 mL无水乙醇,经60 ℃水浴后,置于超声频率40 kHz、功率200 W超声波清洗器内超声,直至溶解,然后稀释成20、40、60、80、100 μg/mL的浓度梯度备用。

1.2.2 抗氧化活性的测定

1.2.2.1 还原力的测定 参照铁氰化钾法进行[11]。取不同浓度的样品0.5 mL,分别加入1.25 mL PBS(0.2 mol/L,pH6.6)和质量分数1%的 K3Fe(CN)6混匀,于50 ℃反应20 min后快速冷却,加入1.25 mL质量分数10%的三氯乙酸,混匀,于3000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL,加蒸馏水2.0 mL,及1 mg/mL的FeCl3溶液0.5 mL,混匀,10 min后于1 cm比色皿中700 nm处测定吸光度。以VC为阳性对照,每个测定对象平行测定3次,取平均值。

1.2.2.2 DPPH·清除能力的测定 取不同浓度的样品2 mL,加入2 mL DPPH乙醇溶液(0.14 mmol/L),混匀后在室温下避光反应20 min,于517 nm处测定吸光度A1;以无水乙醇代替样品为空白体系,其吸光度为A0;以无水乙醇代替DPPH自由基作为对照体系,其吸光度为A2。同时以VC为对照,按以下公式计算清除率[11]。

式(1)

1.2.2.3 羟自由基(·OH)清除率的测定 向25 mL容量瓶中依次加入7.5 mmol/mL邻二氮菲溶液1.0 mL,PBS(pH7.4)5.0 mL,7.5 mmol/mL FeSO4溶液 1.0 mL,一定量的抗氧化剂溶液(损伤管及未损伤不加提取液),体积分数为 0.1% H2O21.0 mL(未损伤管不加),以蒸馏水定容,暗处放置 60 min,在 536 nm 处测吸光度。以上每加一次试剂均需混匀,同时以VC为对照[12]。羟自由基清除率计算按下列公式:

桩西潜山带位于沾化凹陷东部，在沾化、桩东、埕北3凹陷的交汇处，勘探面积220km2，构造上处于埕岛、长堤、埕东三大断裂体系的应力交汇处，断裂系统极为发育，地质构造格局复杂多样。

式(2)

1.2.3 方格星虫抗氧化化学成分分析

1.2.3.1 乙酸乙酯层化学成分分析 本文应用硅胶柱层析,石油醚丙酮(1∶0～0∶1)洗脱,对方格星虫乙酸乙酯层进行分离纯化,经薄层硅胶板检测和合并后,得到四个馏分,分别对其进行 GC-MS 分析。

用氢氧化钾-甲醇甲酯化法对四个馏分分别进行脂肪酸甲酯化,加入正己烷进行脂肪酸甲酯的萃取,静置分层后,取上层有机相(正己烷)适当稀释,用针筒式微孔滤膜过滤器过滤后进行气相色谱-质谱仪进样分析。

气相色谱条件:色谱柱为VF-5MS石英毛细柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);MS条件:电子轰击(EI)离子源,电子能量70 eV,操作系统Xcalibur,谱库NIST 02;分析参数为:初始温度50 ℃,保持2 min,程序升温至130 ℃,速度5 ℃/min,再以25 ℃/min升至300 ℃,保持10 min。

1.2.3.2 水层基本成分分析 蛋白质的测定按照标准:GB 5009.5-2010;脂肪的测定按照标准:GB/T 14772-2008;水分的测定按照标准:GB 5009.3-2010;灰分的测定按照标准:GB 5009.4-2010;氨基酸含量的测定:GB/T 5009.124-2003;总糖含量的测定:GB/T 5009.8;SOD含量的测定按照标准:GB/T 5009.171-2003;牛磺酸含量的测定按照标准:GB/T 5009.169-2003。

2 结果与分析

2.1方格星虫的还原能力

还原力能检验样品是否为一个良好的电子供应者,一般情况下,样品的还原能力与其抗氧化活性之间有显著的正相关,还原力的高低可以反映抗氧化能力的强弱[14]。由图1可知,在40～100 μg/mL的浓度范围内,方格星虫各个提取物的还原力都不如VC的强;在 20～40 μg/mL的浓度范围内,方格星虫水层的还原力比VC的强,具有一定的还原能力,而方格星虫乙醇层和乙酸乙酯层的还原力都不如VC的强,在20 μg/mL 时,方格星虫水层的还原力是VC一倍多,而乙醇层和乙酸乙酯层的还原力与VC的相当。

图1 方格星虫提取物的还原能力Fig.1 Total antioxidant activity of the extracts from S. nudus

2.2方格星虫对DPPH·的清除作用

DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基,其孤对电子在 517 nm 波长附近有强吸收,若有自由基清除剂存在时,孤对电子被配对,吸收消失或减弱,因此通过测定吸收减弱的程度,可以评价受试物的抗氧化活性[13]。由图2可知,在本实验浓度范围内,方格星虫水层对 DPPH·的清除作用随着浓度的增加而增大,且优于阳性对照 VC,而乙酸乙酯层和乙醇层的清除作用不如VC的强。在60 μg/mL 时,VC和水层对 DPPH·的清除率分别为20.25%和50.70%,乙酸乙酯层和乙醇的清除率分别为10.84%和3.93%,水层的清除效果是VC两倍多,而乙酸乙酯层的清除率只有VC的一半左右,乙醇层的清除作用不明显。

图2 方格星虫提取物对DPPH·的清除作用Fig.2 DPPH radical scavenging effects of the extracts from S. nudus

表1 方格星虫乙酸乙酯相的成分分析Table 1 Chemical compositions of the ethyl acetate fraction of S. nudus

续表

图3 方格星虫提取物对·OH 的清除作用Fig.3 OH radical scavenging effects of the extracts from S. nudus

2.3方格星虫对·OH的清除作用

·OH是体内活性最强的自由基,是在生命活动的氧化代谢过程中产生的,可导致大量疾病发生,因此对·OH清除率的检测具有重要意义[11]。由图3可知,在本实验浓度范围内,方格星虫乙酸乙酯层和水层对·OH的清除能力随着浓度增大而增强,且优于阳性对照VC,表明方格星虫乙酸乙酯层和水层对·OH有一定的清除能力。在60 μg/mL 时,VC和水层对·OH的清除率分别为7.53%和89.25%,乙酸乙酯层和乙醇层的清除率分别为27.42%和4.83%,水层的清除效果是VC十倍多,乙酸乙酯层的清除率是VC的三倍多,乙醇层的清除作用不明显。

2.4方格星虫抗氧化化学成分分析

2.4.1 乙酸乙酯层化学成分分析 为了探讨方格星虫乙酸乙酯相的化学组成,本文分别对四个馏分进行了GC-MS分析,得到方格星虫乙酸乙酯相四个馏分的总离子流谱,对各峰通过Xcalibur工作站NIST标准质谱图库进行检索,共鉴定出59个化合物(见表1),包括长链烷烃类、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸和甾醇类化合物及其衍生物,以脂肪酸和甾醇类化合物为主,包括4个胆甾醇、1个麦角甾醇、1个菜籽甾醇,还有大量的二十碳五烯酸(EPA)、花生四烯酸(AA)、亚麻酸(LNA)等有生理功能的不饱和脂肪酸。

方格星虫乙酸乙酯相四个馏分的化学成分有些是重复的,对各馏分的化合物及其含量进行分析后,得到以下结果:馏分一的化学成分以不饱和脂肪酸为主,相对含量最高的化合物为:9,12-硬脂酸甲酯,相对含量为 62.44%;馏分三和馏分四的主要化学成分都为胆甾醇,且相对含量最高的化合物都为:胆甾-5-烯-3-醇(3β),相对含量分别为 75.90%和 66.10%;馏分二的化学成分种类比较多,且相对含量比较分散,相对含量最高的化合物为:14-甲基十五酸甲酯,相对含量为 15.89%,其次为:油酸甲酯,相对含量为 11.52%,第三为:肉豆蔻酸甲酯,相对含量为 10.19%,第四个为:硬脂酸甲酯,相对含量为 8.71%,第五个为:11-二十烯酸甲酯,相对含量为 7.70%,最后为:花生四烯酸甲酯,相对含量为 6.61%,这六个化合物共占到馏分二相对总量的 60.62%。由此可见,方格星虫乙酸乙酯相的化学成分以甾醇和不饱和脂肪酸为主。

表2 方格星虫水层的化学成分Table 2 Chemical composition of the water fraction of S. nudu

2.4.2 水层化学成分分析 为了探讨方格星虫水层的化学组成,本文按照国标法对其进行了化学成分分析,结果见表2。

方格星虫水层具有良好的抗氧化活性,但它是一种混合物,基本成分分析结果显示,它除了含有蛋白质、脂肪、总糖、多肽和氨基酸等成分外,还含有多种抗氧化活性成分,如:牛磺酸、SOD 等,方格星虫水层的主要成分为蛋白质,占总质量的 47.6%,多肽占 23.3%,总糖的含量较低,占总质量的 0.8%,而哪种成分是主要的抗氧化活性成分,还有待于进一步研究。

3 结论

方格星虫的抗氧化物质主要存在于极性部位,乙酸乙酯相和乙醇提取物的抗氧化活性不明显,而水层的体外抗氧化活性明显,能明显清除体系中已产生的DPPH自由基和羟自由基,并在本实验浓度范围内,具有浓度依赖性。

化学成分分析结果显示,方格星虫乙酸乙酯层以甾醇类和不饱和脂肪酸类化合物为主,而水层具有多种成分,除了蛋白质、脂肪、多肽、总糖和氨基酸,还有牛磺酸和SOD等。据文献报道,不饱和脂肪酸[13-14]、海洋动物甾醇[15]、方格星虫多肽[8]、牛磺酸[16-17]和 SOD[18]都具有良好的抗氧化活性,是公认的天然抗氧化剂,已有大量专利文献报道,这些物质都可能是方格星虫抗氧化功效的物质基础,而哪种物质是主要的抗氧化活性成分还有待于进一步研究。

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AntioxidationactivityandcompositionanalysisofSipunculusnudusextracts

XUYan1,XIEYi-xing2,ZOUJie1,LILei-xian3,SUNRen-jie3,WANGXin3,ZHANGQin1,*,NIEZhen-ping1

(1.Guangxi Institute of Oceanology,Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology,Beihai 536000,China; 2.Analysis and Testing Center of Guangxi Province,Nanning 530022,China; 3.Guangxi Key Laboratory of Mangrove Conservation and Utilization,Guangxi Mangrove Research Center of Guangxi Academy of Sciences,Beihai 536000,China)

Objective:To study the antioxidant activity ofSipunculusnudusLinnaeus from the South China Seainvitro. Methods:The homogenate ofS.nuduswas extracted by ethanol,ethyl acetate,and water in order to get fractions with different polarities,and then the antioxidant activity of the extracts was tested,compared with one synthetic antioxidants ascorbic acid. The chemical components of extracts with antioxidant activity were analyzed. Results:The results showed that the water fraction exhibited high antioxidant activity,the ethyl acetate fraction and ethanol extract exhibited low antioxidant activity. 59 compounds were found in the ethyl acetate fraction,which was mainly composed of unsaturated fatty acids and steroids. The water fraction had many components,including protein,total sugar,taurine,SOD and so on. Conclusion:Unsaturated fatty acids,steroids,polypeptide,taurine,SOD might have contributed to the antioxidant activity ofS.nudus.

SipunculusnudusLinnaeus;antioxidant activity;gas chromatography-mass spectrometry;chemical components

2017-04-18

徐艳(1981-) ，女，硕士，副研究员，研究方向：海洋活性物质研究与开发，E-mail：xuyango528@163.com。

*

张琴(1982-)，女，博士，研究员，研究方向：水产动物营养与精深加工，E-mail：zhangqin821220@163.com。

国家自然科学基金项目(31402304)；广西自然科学基金项目 (2015GXNSFBB139005)；广西科学院基本科研业务费 (15YJ22HYS16)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)21-0007-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.002