来源于西洋梨的苹果茎沟病毒分离物基因组分子特性研究

张雪娇+王利平+赵振军+郑银英+陈婕+崔百明

摘要：为了获得来源于西洋梨红贝雷沙寄主潜带苹果茎沟病毒（ASGV）分离物的基因组全长序列，并明确其分子特性，采用RT-PCR、RACE末端克隆及生物信息学方法，对ASGV分离物基因组全长进行序列测定，并对其序列特点进行分析。结果发现，来源于西洋梨的ASGV-HB分离物的基因组全长序列为6 496 nt（GenBank登录号：KU605672），含有2个开放阅读框ORF1、ORF2及2个可变区Ⅵ、Ⅶ。序列分析表明ASGV-HB与GenBank登录的18个ASGV分离物的基因组全长核苷酸序列同源性为80.6%～87.7%；ORF1和ORF2编码的氨基酸同源性分别为843%～92.3%和94.4%～98.7%；Ⅵ和Ⅶ可变区的氨基酸序列同源性分别为22.9%～68.8%和48.8%～922%；系统发育树分析显示，来源于不同国家的相同寄主的ASGV分离物聚集为同一分支。结果表明，ASGV的分子变异无地域相关性，具有一定的寄主选择性，研究结果为进一步探究ASGV的群体遗传进化机制及其防治提供了重要的分子信息。

关键词：梨；苹果茎沟病毒；基因组全长序列；系统发育树分析；同源性

中图分类号： S436.611.1+9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0043-05

收稿日期：2016-05-07

基金项目：国家自然科学基金（编号：31201488）；国家梨产业技术体系（编号：nycytx-29-08）。

作者简介：张雪娇（1990—），女，河南周口人，碩士，研究方向为植物分子遗传学。E-mail：yaqifeixue62@sina.com。

通信作者：崔百明，博士，副教授，研究方向为植物分子遗传学。E-mail：2247237543@qq.com。 苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus，ASGV）为β-线性病毒科（Flexiviridae）发状病毒属（Capillovirus）的代表种[1]，是一种严重危害果树产业的潜隐性病毒。ASGV感染梨树后一般不产生明显的症状，但对产量和品质有严重的影响，给果树生产带来严重的经济损失。且ASGV一旦感染便较难脱除，脱除率仅为68.9%[2]。ASGV存在多种分子变异，目前尚未报道西洋梨寄主ASGV分离物基因组全长序列信息，了解ASGV的分子序列变异特点为研究ASGV的群体遗传和果树防治提供重要的分子依据。自1965年Waterworth首次报道苹果被感染ASGV后，陆续在梨、杏、柑橘、百合、猕猴桃、樱桃等[3-7]植株上发现该病毒。研究明确ASGV基因组含有2个重叠开放阅读框（open reading frame，ORFs），分别编码多聚蛋白（polyprotein）和运动蛋白（MP），多聚蛋白包含4个结构域，分别为甲基转移酶（Met）、类木瓜蛋白酶（P-Pro）、解旋酶（Hel）、RNA聚合酶（RdRp）和外壳蛋白（CP）[8]；ORF2编码36 ku运动蛋白（MP），与复制酶和CP之间存在重叠[9]。ASGV基因组中存在2个可变区（variable regions），称为Ⅵ和Ⅶ，Ⅴ～Ⅰ可变区在基因组523～570 aa位置处，Ⅶ可变区在复制酶和CP之间，位于1 583～1 868 aa位置处跟ORF2区域存在重叠。Liebenberg等通过对Ⅵ和Ⅶ区进行压力选择分析及系统发育树分析，发现ASGV的多样性与寄主存在一定的相关性[10]。目前GenBank登录了来源于日本百合分离物CTLV-L和CTLV-Li-23，韩国砂梨分离物ASGV-P、德国苹果分离物ASGV-AC和印度日本苹果分离物ASGV-P209及来自中国台湾柑橘分离物CTLV-K和CTLV-LCd-NA-1等18个ASGV分离物的全基因组序列，而国内外尚未报道来源于西洋梨寄主的ASGV分离物基因组全长序列。本研究根据GenBank上登录的ASGV分离物基因组全长序列设计引物，并结合RACE技术首次从西洋梨品种红贝雷沙中获得ASGV分离物，命名为ASGV-HB，分析了其基因组结构并进行生物信息学分析，明确其分子进化地位以及该病毒与地域起源和寄主种类的相关性，旨在为进一步探究果树ASGV的群体遗传和防治提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 材料

红贝雷沙枝条于2010年4月采自中国农业科学院郑州果树研究所，取枝条韧皮部作为检测材料，采用引物ASGV-U（5′-CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC-3′）/ASGV-2（5′-GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCC-3′）[11]，经 RT-PCR 检测证实感染ASGV；通过芽尖组织培养获得的离体植株保存于华中农业大学“国家果树无毒种质资源室内保存中心”，取其叶片和茎尖作为本研究提取核酸的材料。

1.2 总RNA的提取

参照报道的CTAB法[12-13]，取待检材料嫩叶和茎尖0.1 g，加液氮研磨成粉末，后加入2%的CTAB缓冲液[2% CTAB、1.5 mol/L NaCl、2% PVP-40、100 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）、20 mmol/L EDTA]和2% β-巯基乙醇，65 ℃水浴后加入等体积水饱和酚 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇[25 ∶ 24 ∶ 1]，取上清加入2.5倍体积无水乙醇和10% 3 mol/L醋酸钠（pH值5.2）沉降RNA，溶于DEPC水中，-80 ℃保存。

1.3 RT-PCR扩增基因组全长序列

根据GenBank上登录的ASGV（GenBank登录号：D16681）基因组序列保守区域设计引物，对ASGV-HB部分片段进行扩增并送公司测序，结合测序结果设计引物扩增其间隔序列。RT-PCR体系20 μL：总RNA 2 μg、6碱基随机引物1 μL，加RNase Free dH2O补足10 μL，混匀后90 ℃温浴 7 min，冰浴3 min，后加入5× M-MLV Buffer 4 μL、dNTPs 1 μL、RRI 0.5 μL、M-MLV 0.5 μL和RNase Free dH2O 4 μL。反应条件：37 ℃ 1.5 h，-20 ℃备用。endprint

PCR反应体系25 μL：10×Taq DNA polymerase Buffer（Mg2+）2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、引物0.5 μL、Taq DNA Polymerase 0.25 μL、cDNA 2 μL、加水补足25 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s（可变），72 ℃ 1 min（可变），34个循环；72 ℃延伸10 min。采用5′RACE和3′RACE（TaKaRa公司）技术获得5′端和3′端序列，送至上海生工生物公司测序。

1.4 ASGV基因组全长序列克隆和序列分析

选取经PCR鉴定为阳性的菌液提交至上海生工生物工程公司武汉分公司测序，采用Vector NTI Advance 11.5.3完成对序列的拼接，多重比对用BioEdit、RDP4等生物学软件完成，系统发育树构建采用DNAMAN（7.0）、MEGA6.0软件，Neighbor-Joining法进行分析，设置1 000次重复，并隐藏了支撑值低于50的数值。

2 结果与分析

2.1 来源于中国西洋梨ASGV-HB分离物基因组全长核苷酸序列分析

将扩增得到的序列利用Vector NTI Advance 11.5.3软件进行拼接，获得ASGV-HB分离物基因组全长为6 496 nt（不含PloyA尾），其序列递交GenBank，获得的登录号为KU605672。利用在线工具对其进行核苷酸编码的开放阅读框预测（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），ASGV-HB基因组结构与报道的ASGV分离物一致，可编码2个重叠的开放阅读框，为ORF1（37～6 354 nt）和ORF2（4 788～5 750 nt），分别编码2 105 aa分子量为241 ku的多聚蛋白和320 aa分子量为36 ku的蛋白；多聚蛋白含有甲基转移酶、木瓜蛋白酶、解旋酶和RNA依赖的RNA聚合酶以及位于基因组C末端27 ku的外壳蛋白。5′UTR含有36个核苷酸，3′UTR 含有142个核苷酸。通过BioEdit软件对ORF1氨基酸进行多重比对发现，ASGV-HB基因组中存在与其他ASGV分离物基因组相似的2个可变区，分别为Ⅵ（532～570 aa）和Ⅶ（1 538～1 868 aa）。Ⅶ区与ORF2部分区域重叠。因此，基于预测的蛋白保守功能结构域，ASGV-HB分离物基因组结构见图1。将ASGV-HB分离物与GenBank上收录的来源于不同寄主及不同地域的18个ASGV分离物的基因组全长序列及部分编码区氨基酸进行同源性比较， 结果（表1、表2）表明，ASGV-HB与此18个ASGV分离物的基因组全长核苷酸序列相似性为80.6%～87.7%。其中ASGV-HB全长序列与日本苹果上的P-209分离物全长序列相似性最高，为87.7%；ORF1和ORF2氨基酸同源性分别为

843%～92.3%和94.4%～98.7%，可变区Ⅵ（532～570 aa）和Ⅶ（1 583～1 852 aa）氨基酸相似性分别为22.9%～688%和48.85%～92.2%，5′端UTR和3′端UTR核苷酸相似性分别为100%和98.6%。

将ASGV-HB和GenBank数据库上收录的来源于不同国家或地区的苹果、梨、柑橘和百合寄主的18个ASGV分离物基因组全长序列进行系统发育树分析（图2）。结果表明，19个ASGV分离物可聚为3个组群，分别命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。Ⅰ组群分为2个分支，其中来源于日本的百合Li-23和L聚为1个分支，ASGV-HB分离物为独立分支，与日本和中国的苹果、柑橘和梨分离物（YTG、HH、CHN、MTH、P209和T47）聚为Ⅰ组群。Ⅱ组群由3个分支组成，其中来源于美国和中国寄主的柑橘分离物（分别为STJ、XHC、K、Lcd-NA-1、PK、ML）聚集为1个分支；来源于印度和德国的苹果寄主AC和P12的分离物聚集为另一个分支，来源于中国砂梨的分离物ASGV-J2单独为1个分支；来源于韩国寄主的梨SK分离物单独聚为Ⅲ组。

2.2 ASGV-HB分离物mp基因核苷酸序列分析

ASGV-HB分离物与报道的18个分离物mp基因核苷

酸序列同源性为78.5%～96.4%，与报道的中国砂梨分离物ASGV-J2相似性最高。进而对其ASGV分离物的mp基因在核苷酸水平上进行系统发育树分析，结果表明，共分析的19个分离物分为2个组群，分别命名为Ⅰ和Ⅱ组群。Ⅰ组群包含2个分支，其中来源于中国和美国的柑橘mp分离物均聚为1个分支，来源于南非、印度和德国的梨与苹果寄主的mp分离物聚为另一个分支。Ⅱ组群主要分为2个分支，其中ASGV-HB西洋梨分离物与来源于中国的砂梨J2分离物聚为同一分支；来源于中国和日本的苹果、梨、柑橘和百合分别聚集为同一个分支的随寄主而选择的不同簇（图3）。

2.3 ASGV-HB分离物cp基因核苷酸序列分析

将ASGV-HB分离物与选取的GenBank上登录的来源于中国、日本、南非、印度、韩国、德国的苹果、梨、百合、柑橘和竹子寄主上的34个ASGV分离物基于cp基因序列的同源性为88.85%～95.5%，与来源于日本的P209苹果分离物的同源性为95.2%。进而对cp基因进行系统发育树分析，结果（图4）表明，来源于不同寄主的35个ASGV分离物可分为3个组群，分别命名为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。Ⅰ组群包含2个分支，其中来源于南非的苹果独立成簇，与中国不同地区柑橘的cp基因分离物聚为1个分支； 来源于巴西、日本、中国、印度、南非和

德国的梨、苹果、柑橘和竹子的cp分离物分别聚集为同一个分支的随寄主而选择的不同簇，其中ASGV-HB cp基因分离物与来源于南非、巴西、日本和中国的梨与苹果的cp分离物（A19、HPHF15、T47、P209和MP220）聚為此分支的同一簇；来源于中国的苹果和柑橘聚为第Ⅱ组；来源于美国的柑橘单独成簇，与来源于印度的苹果聚为第Ⅲ组。endprint

3 讨论与结論

本研究采用RT-PCR结合末端RACE法首次对采集自中国农业科学院郑州果树研究所西洋梨红贝雷沙样品的ASGV分离物，即ASGV-HB的基因组进行扩增和测序，获得其全长序列为6 496 nt（不含ployA），包含2个完整的ORFs。其中ORF1编码含有4个保守结构域的复制酶蛋白（Rep）以及外壳蛋白（CP），ORF2编码运动蛋白（MP），以及序列变异明显的Ⅵ和Ⅶ区。报道显示，ASGV的cp和mp基因均通过亚基因组表达[14]，cp通过亚基因组表达引起寄主系统感染，在cp亚基因组（subgnomic RNA，sgRNA）编码区上游存在转录起始位点AUG及cp sgRNA表达所需的6碱基保守核心启动子序列UUAGGU，共同调控cp基因表达，同时对ASGV的侵染活性有重要影响[15]。本研究得到的ASGV-HB基因组序列 5 602～5 607 nt位置处含有此六碱基序列UUAGGU，此序列为cp sgRNA起始转录位点的核心碱基序列。在其后 5 640～5 642 nt 位置处推测为cp sgRNA的起始位点AUG。

为了进一步明确其分子序列特性和遗传进化关系，将ASGV-HB分离物与GenBank上登录的来源于国内外的梨、苹果、柑橘和百合共4种寄主的18个ASGV分离物进行基因组核苷酸水平相似性比较，结果表明，ASGV-HB分离物与来源于日本的苹果分离物P209相似性最高，且在系统发育树中聚为同一组群同一分支（表2、图2）。对19个分离物进行mp基因水平上的序列分析结果也显示，ASGV-HB分离物与P209位于同一组群，但是聚集为不同分支，与来源于中国的砂梨J2分离物聚集为同一分支，遗传距离最近。另外，我们对ASGV-HB分离物与GenBank登录的34个分离物进行cp基因遗传进化关系分析，结果也表明，来源于不同国家和地区的寄主分离物聚集为同一组群同一分支。因此，基于ASGV基因组全长核苷酸、mp和cp基因核苷酸水平上的遗传进化分析均表明，ASGV具有分子变异特点，显示出与寄主的相关性。进而分析了ASGV-HB分离物Ⅵ和Ⅶ区氨基酸序列，结果表明，ASGV-HB分离物Ⅵ区氨基酸序列同源性仅为229%～68.8%，Ⅶ区同源性为48.8%～92.2%，且遗传进化关系也揭示了该分离物与来源于苹果和梨寄主的分离物进化关系较近。赵磊研究结果表明ASGV的cp基因分子变异趋势具有一定的寄主选择性，不存在明显的地理差异[16]。本研究结果与Liebenberg等[10]报道的ASGV分离物变异区Ⅵ和Ⅶ的进化分析也揭示了遗传进化关系与寄主有相关性，而与地理位置无任何关联相似。推测可能与不同国家间种质材料交换而导致了携带该病毒的分子遗传进化与来源无相关性有关。研究结果为进一步研究ASGV的群体遗传和深入探讨其进化机制提供了重要的分子信息，也为深入探究其基因组致病性功能及构建其侵染性克隆提供了材料。

参考文献：

[1]Martelli G P，Adams M J，Kreuze J F，et al. Family flexiviridae：a case study in virion and genome plasticity[J]. Phytopathology，2007，45：73-100.

[2]张尊平，张少瑜，洪 霓，等. 热处理脱除梨病毒技术研究[J]. 北方果树，2001（5）：8-9.

[3]Wu Z B，Zheng Y X，Su C C，et al. Identification and characterization of apple stem grooving virus causing leaf distortion on pear （Pyrus pyrifolia） in Taiwan[J]. European Journal of Plant Pathology，2010，128（1）：71-79.

[4]Inouye N，Maeda T，Mitsuhata K. Citrus tatter leaf virus isolated from lily[J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan，1979，45：712-720.

[5]Lovisolo O，Accotto G P，Masenga V，et al. An isolate of apple stem grooving virus associated with Cleopatra mandarin fruit intumescence[J]. Tropical Plant Pathology，2003，28（1）：54-58.

[6]Clover G，Pearson M，Elliott D，et al. Characterization of a strain of apple stem grooving virus in Actinidia chinensis from China[J]. Plant Pathology，2003，52（3）：371-378.

[7]Campbell A. The effect of some latent virus infections on the growth and cropping of apples[J]. Journal of Horticultural Science，1963，38（1）：15-19.

[8]Hirata H，Lu X，Yamaji Y，et al. A single silent substitution in the genome of apple stem grooving virus causes symptom attenuation[J]. Journal of General Virology，2003，84（9）：2579-2583.endprint

[9]Zhou Y，Holmes E C. Bayesian estimates of the evolutionary rate and age of hepatitis B virus[J]. Journal of Molecular Evolution，2007，65（2）：197-205.

[10]Liebenberg A，Moury B，Sabath N，et al. Molecular evolution of the genomic RNA of apple stem grooving capillovirus[J]. Journal of Molecular Evolution，2012，75（3/4）：92-101.

[11]James D. A simple and reliable protocol for the detection of apple stem grooving virus by RT-PCR and in a multiplex PCR assay[J]. Journal of Virological Methods，1999，83（1/2）：1-9.

[12]张 涛，韩 梅，刘翠晶，等. 人参总RNA提取方法及后转录酶的比较[J]. 江苏农业科学，2015，43（8）：34-37.

[13]董 璐，贾红梅，刘 迪，等. 菊花叶片总RNA提取方法的比较研究[J]. 江苏农业科学，2016，44（3）：67-69.

[14]Hirata H，Yamaji Y，Komatsu K，et al. Pseudo-polyprotein translated from the full-length ORF1 of capillovirus is important for pathogenicity，but a truncated ORF1 protein without variable and CP regions is sufficient for replication[J]. Virus Research，2010，152（1/2）：1-9.

[15]Komatsu K，Hirata H，Fukagawa T，et al. Infection of capilloviruses requires subgenomic RNAs whose transcription is controlled by promoter-like sequences conserved among flexiviruses[J]. Virus Research，2012，167（1）：8-15.

[16]趙 磊. 苹果茎沟病毒的全基因组测序及其侵染性克隆载体的构建[D]. 杨凌：西北农林科技大学，2013：19-21.张高阳，邓接楼，柯维忠，等. 红麻肌醇加氧酶基因的分离及表达分析[J]. 江苏农业科学，2017，45（18）：48-50.endprint