应用于微型PCR荧光检测仪的光学系统设计

李润芝，杨 波，郭彩虹，袁旭军

(1.上海理工大学 光电信息与计算机工程学院，上海 200093；2.上海科源电子科技有限公司，上海 201101)

应用于微型PCR荧光检测仪的光学系统设计

李润芝1，杨 波1，郭彩虹2，袁旭军2

(1.上海理工大学 光电信息与计算机工程学院，上海 200093；2.上海科源电子科技有限公司，上海 201101)

针对实时微型PCR荧光检测仪系统的核心-光学模块目前仍然存在系统灵敏度低、能量利用率低、聚焦光斑大等问题。文中采用在原共聚焦型光路系统基础上改进元器件的方法，利用全反射透镜收集准直光线，采用非球面透镜进行光线会聚，优化材料选择。搭建实验系统进行实验，实验结果表明，此系统解决了原系统存在的问题，检测灵敏度达到0.01 ng/mL(荧光素)，比原系统提高了10倍，可在实际检测中使用。

非成像光学；PCR荧光检测仪；全反射准直透镜；非球面；光学系统设计

聚合酶链式反应(Polymerize Chain Reaction,PCR)是一种在体外特异性扩增已知序列的核酸片段的技术[1]，具有快速方便、特异性高等优点，目前已在生命科学、医学工程、遗传工程等领域得到了广泛应用，成为传染病和遗传病的主要检测手段[2-3]。与传统的PCR仪相比，本文所述PCR微芯片具有体积小、反应速度快、操作简便、便于集成化等特点[4]。由于微型PCR仪采样样品少，需进一步提高其灵敏度；为满足其便携性，仪器需更微型化、集成化。本文针对上述问题，采用自由曲面折反射系统与非球面聚焦透镜，优化设计光学系统。

1 光学系统设计

目前，通常用于荧光检测的光路系统有：共聚焦型光路、正交型光路[5]、斜入射式和平行式光路。共聚焦型光路系统的激发光会聚系统和荧光收集准直系统都由同一个透镜完成，其聚焦光斑和光阑分别位于此透镜的共轭焦点[6]，只有聚焦光斑处样品发出的荧光才能到达检测窗，其它部位非特异信号被选择性地屏蔽，受外界杂散光影响较小，结构相对简单。因此，本文基于共聚焦型光路进行光学系统设计，提高光能利用率以获得优良的荧光激发效果。具体光路如图1所示。

图1 光学系统的光路结构示意图

图1为光路的正视图和样品端的左视图，上述荧光检测系统光路设计重点在于光线收集准直系统的光能收集率与准直效果、光线会聚系统的光斑聚焦大小以及荧光发射光束的再次收集与准直系统设计。

1.1 光线收集准直系统设计

传统的光线收集准直系统采用折射式结构，但是由于系统尺寸限制，对于大角度光线收集能力较弱，光能利用率很低。本文采用全反射透镜，小角度光线采用二次曲面透镜准直，大角度光线通过全反射透镜准直[7-8]。全反射透镜整体结构如图2所示。

图2 全反射透镜结构

图2中1为小角度光线会聚透镜；3为收集大角度光线的全反射面。其中面1可设计为球面或者二次曲面；面2可为平面，球面，二次曲面，自由曲面[9]；面3可为二次曲面或自由曲面。本文设计第1面设计为二次曲面；第2为平面，为满足注塑加工的工艺要求，面2需要有>2°倾斜角；面3为自由曲面。

小角度二次曲面[10]准直透镜面1根据等光程原理设计，如图3所示。

图3 准直透镜光路

光源位于透镜焦点F处，设材料折射率为n；FA长度为a；AB长度为b；设B为坐标原点；C点坐标为(-x，-y)；F点出射C点光线经透镜由D点准直出射，需满足等光程条件，根据各点坐标，可得

(1)

该曲线为二次曲线，即为准直透镜小角度折射透镜面型截面曲线。

图2中大角度光线全反射面3常用方法为以点光源为基本光源，通过斯涅尔定律以及数学方法，采用离散点计算法求解自由曲面面型。也可以将面2和面3组成的全反射准直光路在LightTools软件中建模，视为折反照明系统，优化光路准直，这样的设计过程更为简化，充分利用软件自动优化功能。

图4 自由曲面透镜、优化评价函数

自由曲面全反射透镜旋转对称，自由曲面母线建模采用单向贝塞尔曲线，采用布尔运算将1、2、3面连接为整体结构。优化首先对NS光线准直优化，评价函数如图4(b)所示。后对面光源，利用Light Tools光强切片优化方法进行优化[8]。最终得到有效全反射透镜，如图4(a)所示。

1.2 光线会聚系统设计

此系统样品端聚焦光斑越小其荧光激发效果越好，为矫正主要像差球差，本文采用非球面透镜作为样品端会聚镜。根据其机械结构的要求，工作距离为12 mm，受激发荧光进入系统出光角度为52°。大数值孔径的物镜可有效提高荧光的收集效率[11]，为最大限度地接收荧光，本文将透镜口径设为被允许的最大尺寸12 mm。为了节省成本，降低加工难度，本文采用平凸透镜[12]，材料为PMMA。

数值孔径NA的计算公式如下

NA=nsinθ

(2)

其中，n表示介质的折射率；θ表示物镜半孔径角[13]。

根据多项式非球面式(3)

(3)

其中，r2=x2+y2，c为表面极位置的曲率；K为曲面常数；A～D是第4到第10阶变形项[13]。根据上述设计要求与思路，采用偶次非球面，消除系统球差，通过CODEV软件进行优化可得其面型系数。

1.3 光源的选取

检测物质吸收激发光，受激发出特定波段荧光[13]，本文针对样品中添加FAM荧光染料选取光源。FAM荧光素激发光波段的最大波长为490 nm，发射波段的最大波长为520 nm。本文采用1 mm×1 mm中心波长为470 nm，波谱范围为460 ～480 nm的LED作为激发光光源。

1.4 滤光片的选取

由于此光学系统的成像信号微弱，以及很多光学元件的多次散射的影响，对杂散光进行抑制、提高系统的信噪比显得尤为重要[14-15]。激发波段和发射波段具有光谱重叠区[4]，为解决光谱重叠问题，防止系统受到杂散光的影响，本文采用截止深度为OD6的滤光片。在激发光路中采用中心波长为470 nm，带宽20 nm的滤光片，在探测器的接收端采用中心波长为525 nm、带宽20 nm的发射滤光片，减少杂散光对系统的影响。

2 基于Light Tools软件的模拟仿真

根据上述理论与尺寸需求，具体搭建PCR荧光检测仪光路，建立透镜模型，设置合理菲涅尔损耗属性，在样品处添加1 mm×1 mm接收器。透镜口径均<20 mm，荧光激发光路总长60 mm，优化后整个光学模组的尺寸为：60 mm×50 mm×25 mm。最后进行光线追迹。

图5 优化后模拟光路的正视图和左视图

图6 原系统模拟光路的正视图和左视图

图7 样品端光斑图

图5为本文设计PCR荧光检测器模拟光路图，图6为原系统光路图。图6中容易发现大角度光线通过折射系统，收集准直能力较弱，光能利用率低且杂光干扰较多，降低系统灵敏度。图5中优化后系统准直度显著提高且大角度光线通过全反射透镜被收集。图7(a)为优化后系统样品光斑，明显小于图7(b)原系统样品光斑。证明自由曲面与非球面配合准直的光路系统有效优化系统由于光源尺寸造成的慧差等轴外像差，同时进一步矫正球差，聚焦光斑缩小，聚焦效果显著改善。设置系统的光源光通量为100 lm，样品端接收的能量为92.74 lm，光能利用率>92%，较原系统提高2倍。

3 实验验证与数据分析

校准光路使光斑居于透镜中心，如图11所示，确保光路准直。将光学模块放到PCR检测仪中，设置零位固定安装，进行发光测试。将光强统一设置为200，样品分为高中低3种浓度，实验时间设置为60 min，本文设计方案与传统方案的结果如图8所示。

图8 荧光检测实验结果

由图8的实验结果图可以看出：在相同光强200的设置下，传统荧光检测器低浓度值荧光AD[5]值为6 600，本文设计的光学系统低浓度荧光AD值为17 000，中浓度和高浓度的数值已经饱和到达72 000。通过实验证明：整个系统的灵敏度提高了10倍，达到0.01 ng/mL，充分说明本系统的灵敏度显著提高，光能利用率高、激发荧光效果好，系统稳定性较强。

4 结束语

光学设计模块是PCR荧光检测仪重要研究方向之一。本文基于共聚焦型光路系统，设计折反系统(全反射透镜)收集准直光线，比传统折射系统提高光能利用率2倍以上；利用非球面透镜消除球差、慧差等像差影响，有效缩小聚焦光斑。解决传统系统灵敏度低、能量利用率低、聚焦光斑大等问题，可用于实际检测。

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Optical System Design of Miniature PCR Fluorescence Detector

LI Runzhi1,YANG Bo1,GUO Caihong2,YUAN Xujun2

(1.School of Optical-Electrical and Computer Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China;2.Shanghai Cohere Electronics Technology Co.,Ltd,Shanghai 201101,China)

There are still some problems in the core optical module of real time miniature PCR fluorescent detector system such as: low sensitivity of the system,low energy utilization rate,and big focal spot etc. Confocal optical system is still used in this paper and optimization designs of the original optical path system are adopted based on the fact of production; for instance,replacing the traditional lens with TIR Collimating Lens; focusing the optical path by using the aspheric lens,and improving the selection of lens materials. Finally,the test platform is built,experimental results verify that the sensitivity of the new system is increased by 10 times than before,it reaches 0.01ng/ml(fluorescein) and the new system can be used in practical production.

non imaging optics; PCR fluorescence detector; TIR collimating lens; aspheric surface; optical system design

TN247

A

1007-7820(2017)11-034-04

2016- 12- 22

国家重大科学仪器设备开发专项基金(2013YQ470765)

李润芝(1991-)，女，硕士研究生。研究方向：光学设计等。杨波(1977-)，男，博士，副教授。研究方向：光学设计。

10.16180/j.cnki.issn1007-7820.2017.11.010