非干扰条件下圈养大熊猫正常生理生化指标的测定

罗 娌 兰景超 刘 礼 黄文俊 廖礼慧 陈 欣 杨 智 王成东

(成都大熊猫繁育研究基地，成都，610081)稿件运行过程

非干扰条件下圈养大熊猫正常生理生化指标的测定

罗 娌 兰景超 刘 礼 黄文俊 廖礼慧 陈 欣 杨 智 王成东*

(成都大熊猫繁育研究基地，成都，610081)稿件运行过程

大熊猫；非干扰条件采血；生理生化指标参考范围；年龄组；性别

2006～2015年间，通过驯化，在非麻醉状况下成功采集了114只大熊猫(♀58只，♂56只)2 399份血样进行了50项生理生化指标检测，建立非干扰条件下大熊猫正常生理生化指标参考范围。统计分析发现某些生理生化指标随着年龄的增长表现出显著性差异；酶类指标波动范围较大，个别指标表现出与年龄相关的变化趋势；成年组雌性和雄性大熊猫生理生化指标较幼年组、亚成年组和老年组表现出更多性别相关的差异，临床上需按性别区别对待。受种群健康状况改善、样本数量和采样方式改变的影响，现有的非干扰状态下血液生理生化指标更适用于成都圈养大熊猫种群健康水平的评估，有助于科研工作者保护这一特殊物种。

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)圈养的历史可追溯到上世纪三十年代，在过去的八十余年间，大熊猫人工圈养种群从八十年代末的118只发展到现在的425只，大熊猫的健康关系到整个大熊猫种群的发展。近年来，在大熊猫行为学、繁殖学、营养学、兽医学等方面的研究均取得了长足进步，大熊猫血液学水平成为临床兽医和动物管理者评判大熊猫健康与否最基础的指标。由于受到种群数量和样品收集方式的限制，系统报导大熊猫血液学研究结果的文献非常有限。董全[1]、Mainks[2]、王强[3]、李光汉[4]等分别报导了不同机构大熊猫的血液生理生化参数，由于受试大熊猫数量从3只到28只不等，个别受试动物来自野外抢救属于非健康状态，所得到的生理生化指标不能代表健康大熊猫种群的正常水平。李才武等[5]发表了120只圈养大熊猫血液生理指标，由于其样本的采集既包括麻醉状态也包括非麻醉状态，我们无法排除麻醉这一应激对正常血液指标产生的影响，同时该文章仅报导了生理指标参考范围，无血液生化指标的结果。从现有文献报导来看，未指出受试动物是否在同一年龄段进行多次采样，如果重复使用一个或部分个体的多个血样，最终得到的变化范围将无法代表整个受试对象的真实水平。

为了建立非干扰状态下大熊猫正常生理生化指标参考范围，成都大熊猫繁育研究基地自2006年开始对圈养大熊猫进行驯化，大熊猫自愿接受血液采集，排除应激对血液学指标的干扰。经过9年的样本收集，共采到114个健康个体2 399份血样，对50个常用血液学指标进行了检测，建立了成都大熊猫繁育研究基地各年龄段大熊猫血液生理生化指标正常参考范围。通过对血液检测指标的分析发现随着年龄的增长或性别的不同，某些指标表现出显著性差异，具有一定的生理意义。该研究结果有助于兽医对大熊猫的健康状态进行有效评估，及早发现患病动物，也为动物管理者的日常饲养管理提供可靠的实验室依据，同时可为其他大熊猫饲养研究机构提供理论参考。

1 研究方法

1.1 受试动物

114只受试动物均饲养于成都大熊猫繁育研究基地，年龄从5月龄到32岁，具体性别、年龄分组见表1。所有动物受试期间精神、食欲、大小便正常，视为健康个体。投喂的食物由竹子、竹笋、精料和苹果构成，其中竹子或竹笋投喂量超过每日投喂总量的90%。定期投喂驱虫药(害获灭，0.2 mg/kg，1%伊维菌素无菌注射液，梅里亚国际贸易上海有限公司，噻吩嘧啶，6 mg/kg，Pfizer公司生产)。每年注射犬瘟热疫苗(Purevax®，梅里亚公司生产)和狂犬疫苗(Nobivac®，英特威公司生产)。大熊猫分组根据张志和等提出的0～18月龄为幼年大熊猫，1.5～5岁为亚成年大熊猫，5～20岁为成年大熊猫，20岁以上为老年大熊猫[6]。

表1 受试大熊猫年龄与性别分组

Tab.1 Age and sex groups of giant pandas

1.2 采样方式

在驯化状态下，从大熊猫右上肢或左上肢静脉，用22号针头和真空采血管进行血液采集。血液分成2份，一份为EDTA抗凝，另一份无抗凝剂离心分离血清(1 500 rpm，15 min)。所有样品送至成都市四一六医院进行生理、生化检测。用于检测血常规的机器为BC-5800 (迈瑞科技有限公司，中国)。血生化检测仪器为AU2700 (奥林巴斯，日本)。

1.3 统计分析

所有测试数据使用SPSS 23(SPSS Inc.，芝加哥，美国)和R 2.15.0 (R Core Development Team，2012)进行统计分析。2 399份血样来自114个个体，每个个体在不同年龄段皆多次采样。将同一个体在同一年龄段的所有血液检测结果平均后得到的平均值作为该个体该年龄段的最终检测结果。血液生理生化正常范围通过平均值、标准差和个案数体现[7]。每个年龄组先计算平均值和标准差，任何超过平均值±3X标准差的结果将作为极值不再纳入之后的计算和检验。对于符合正态分布的数据使用ANOVA进行统计分析，而不符合正态分布的数据将通过R进行Kruskal-Wallis检验[8]。不同年龄段的两两比较通过LSD或者kruskalmc进行分析。老年组参与血样采集的雄性大熊猫个体数仅有2个，故不进行同年龄组性别间差异性比较。

2 结果

本研究共检测生理、生化指标50项(表2)，部分生理生化指标随年龄增长而表现出显著性差异。由于成年大熊猫生理、生化指标性别差异显著，其结果单独由表3例出。

成都大熊猫繁育研究基地大熊猫正常生理生化指标变化范围(表2)。

表2 幼年、亚成年、成年和老年组大熊猫生理生化指标

Tab.2 Hematologic and biochemical reference of infant，subadult，adult and aged giant pandas

续表2

注：针对常用生理生化指标进行差异性检验，标相同字母为差异不显著，标不相同字母为差异显著(P<0.05)，未标字母指标未进行差异性检测

Note：Most common used hematologic and biochemical parameters were tested.No significantly difference was showed by same alphabet and significantly difference was showed by different alphabet.Unlabled hematologic and biochemical parameters didn’t tested

表3 雌性、雄性成年大熊猫生理生化指标

Tab.3 Hematologic and biochemical reference of male and female adult giant pandas

续表3

续表3

注：*表示差异显著P<0.05，**表示差异极显著P<0.01

Note：*Showed signifcantly difference，P<0.05，**showed extremely signifcantly difference，P<0.01

3 讨论

3.1 本文第一次详细报导了非干扰情况下不同年龄段和不同性别圈养大熊猫的生理和生化指标参考范围。已有多篇报导指出应激对血液生理生化指标的影响[6，9-10]。通过比较麻醉与非麻醉大熊猫血液生理指标后发现红细胞、白细胞、血小板、平均血红蛋白浓度和血小板压积等指标差异极显著。所以在完全排除麻醉这一应激原后，得到的数据更能真实地反映大熊猫血液学指标的实际结果，为临床兽医评估动物健康状况提供了更加可靠的评判标准。

3.2 王强[3]、李光汉[4]和张志和[6]等曾报导过成都大熊猫种群血液正常生理生化指标的参考范围。本研究发现2006年后的生理生化指标与2006年以前的数据相比，部分指标表现出较大差异，主要表现在：(1)2006年以后各年龄组反映动物营养水平的指标如总蛋白、血清白蛋白、白蛋白/球蛋白、血红蛋白等普遍高于之前的报导；(2)2006年以后反映的肝功指标如总胆红素、直接胆红素和间接胆红素水平等显著低于张志和等[6]所报道水平。各项血液生理生化指标的改善与成都大熊猫基地自2006年以来所采取的一系列大熊猫健康管理措施密切相关。临床上，整个圈养大熊猫种群发病率下降，新生幼仔存活率提高并能平稳渡过发病率较高的亚成年期。2006年以后成都大熊猫繁育研究基地再无生长发育不良的“僵猫”出现，整个种群健康水平明显改善。

3.3 不同年龄组血液生理生化指标比较

随着年龄的增长，反映其营养状态、肝功、肾功的几个指标总体变化规律为幼年最低，成年后则达到最高水平，老年后维持或略有下降。与熊科(Ursidae)其他熊类相比，大熊猫葡萄糖水平接近眼镜熊 (Tremarctosornatus)水平[10]低于棕熊(Ursusarctos)[11]；总甘油三脂水平较黑熊(Ursusthibetanus)[12-13]和眼镜熊[10]水平低；各种血清酶类的变化范围都比较大，这是因为酶很容易被干扰，如应激、剧烈运动、饮食、器质性病变等。受试大熊猫的丙氨酸氨基转移酶和门冬氨酸氨基转移酶水平较其他大熊猫文献所报道的水平都高，而与熊类相比，则高于眼镜熊[10]和黑熊[12-13]，但低于棕熊[11]。导致成年大熊猫丙氨酸氨基转移酶和门冬氨酸氨基转移酶水平升高的原因是否与成年大熊猫处于发情期或妊娠期、育幼期相关，值得进一步的研究。碱性磷酸酶能够反映骨形成和成骨细胞代谢的活性。幼年动物往往因为处于生长期而有较高的碱性磷酸酶、钙和磷水平，随着年龄的增长，各项指标水平则逐步下降，如黑熊[12-13]、棕熊[11]和北极熊(Ursusmaritimus)[14]等，大熊猫也有类似的变化趋式。受试大熊猫的血淀粉酶水平较张志和等[6]和王强等[3]报道的水平都高，但大熊猫并未表现出任何相关临床症状。

随着年龄的增长，白细胞总数、淋巴细胞所占比例逐渐下降，中性粒细胞比例不断上升，成年后逐渐稳定，与李才武等[9]所报道的结果并不一致。与此同时红细胞计数、血红蛋白、血细胞压积和平均红细胞体积从幼年时期的最低水平逐步上升，成年后稳定在一定水平，到老年后开始下降。血小板水平与李才武等[5]和张志和等[6]报道的水平都更高。所有受试大熊猫均未表现出任何与血小板增多症相关的临床症状。造成这种差异的原因还需进一步研究。

3.4 不同性别血液生理、生化指标比较

在已经进行分组比较的生理、生化指标中，我们发现大部分指标在幼年和亚成年是没有显著的性别差异，而是到了成年期才表现出来。这提示我们性成熟对大熊猫的生理、生化指标是有影响的。王强等[3]指出雌、雄性大熊猫生理生化指标差异不显著，这可能与受试动物中只有15个个体有关。Mainks等[2]也指出成年雌性和雄性大熊猫在红细胞总数、血甘油三脂存在性别差异。刘太秀等[15]通过对育成黑熊的血液生理生化指标的测定，也发现雌性和雄性黑熊部分生理生化指标存在极显著差异。在临床上不同性别的成年大熊猫的正常生理、生化指标需区别对待。

综上所述，随着大熊猫圈养种群的扩大，其正常生理、生化指标需要更新，通过非干扰条件下得到的数据更能反映大熊猫真实健康状况，帮助动物管理者对大熊猫的体况进行正确评估，最终维持一个健康可持续发展的种群。

致谢：感谢成都大熊猫基金会对本研究的经费支持(项目编号：CPF08011)。感谢成都大熊猫繁育研究基地饲养员的辛勤工作，完成了每一只受试大熊猫的驯化，本研究才得已顺利进行；感谢James E Ayala 在驯化采血方面的大力支持；感谢刘颂蕊对本研究提供的宝贵建议；感谢Jacob Robert Owens对本研究中数据分析提供的无私帮助。感谢燕霞、陈杰对原始数据录入的大力帮助。

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Giant panda；Non-stress sampling methods；Hematologic and biochemical reference；Age groups；Sex groups

Hematologic and Biochemical Reference of Captive Giant Pandas Based on Non-stress Sampling Methods

Luo Li Lan Jingchao Liu Li Huang Wenjun Liao Lihui Chen Xin Yang Zhi Wang Chengdong*

(Chengdu Research Base of Giant Panda Breeding，Chengdu，610081，China)

From 2006 to 2015，we collected 2 399 blood samples from 114 giant pandas (58 females and 56 males)，which were well trained and cooperative to blood sampling without anesthesia.We tested 50 physiological and biochemical criteria of these blood samples to set up the range of normal physiological and biochemical criteria of pandas under no stress.We documented significant differences in some hematologic and biochemical parameters by age group.Although enzyme values varied widely，some varied by age.Hematology and serum chemistry values for adult pandas showed more significant difference by sex compared with juvenile，subadult and old groups，so the clinical diagnosis of adult panda should consider the gender difference.We developed new references for hematology and serum chemistry values based on the improvement of giant panda groupings，larger samples and new sample collection methods.The data recorded using the new methods were more useful for evaluation of the health status of captive giant pandas at Chengdu and for improving the conservation of this iconic species.

2016-10-11

修回日期：2017-07-05

发表日期：2017-11-10

Q592.1

A

2310-1490(2017)04-580-07

提高圈养大熊猫种群健康和繁殖能力的技术研究(批文号：CPF08011)

罗娌，女，36岁，硕士研究生，副研究员；主要从事野生动物保护与疾病研究。E-mail：luoli2002@163.com

*通讯作者：王成东，E-mail：wcdsyy@sina.com