圈养黑熊妊娠中后期尿液中孕酮含量变化研究

郑程莉 刘太秀周 磊 汪晓郓

(四川养麝研究所，成都，611845)稿件运行过程

圈养黑熊妊娠中后期尿液中孕酮含量变化研究

郑程莉 刘太秀1周 磊 汪晓郓

(四川养麝研究所，成都，611845)稿件运行过程

圈养黑熊；孕酮；酶联免疫技术；妊娠期

为研究圈养雌性黑熊(Ursusthibetanus)妊娠中后期尿液中孕酮含量变化规律，试验采用酶联免疫技术，2016年10月11日开始，至12月13日止，连续2个月测定四川养麝研究所黑熊养殖试验场6头圈养母熊妊娠中后期孕酮的含量变化。试验结果表明：(1)试验组3头圈养繁殖母熊孕酮含量最高值为39.54 ng/mL，最低值2.45 ng/mL，其中孕酮含量测定值在11月可达10 ng/mL以上；对照组3头取胆母熊，孕酮含量最高值32.62 ng/mL，最低值0.05 ng/mL，其孕酮含量在11月和12月均在10 ng/mL以下；(2)试验组3头母熊尿液中孕酮含量呈现有规律的波动式变化，且3头配种母熊孕酮有1～2个峰值；对照组3头未配种取胆母熊孕酮值呈无规律性变化，其孕酮值显著低于试验组。研究表明：试验组3头母熊均顺利产仔，配种圈养黑熊尿液孕酮含量变化能反映其妊娠期间胎盘发育情况，通过测定圈养黑熊孕酮含量的变化规律对判断圈养黑熊妊娠将起到指导作用。

由于黑熊(Ursusthibetanus)是国家Ⅱ级保护野生动物，驯化程度不够，人不易接近。黑熊在配种后，受精卵并不是立即着床发育，而是在子宫内游离一段时间后，在11月底或12月初开始着床，胎儿发育在最后6～8周内完成，产仔多在翌年的1～2月[1]。母熊的腹围在临产前1个月左右才有增大，但不甚明显，尤其在圈养条件下，难以判断其妊娠与否。因黑熊在冬季妊娠，并且有冬眠现象，有时会因人为疏忽导致其产仔未能及时得到护理，造成新生幼熊死亡。为了提高新生幼熊成活率，预测母熊妊娠时间，显得尤为重要。

目前，有关黑熊早期妊娠诊断的研究报道为数不多，文泓淳等[2]最早采用多普勒法和激素对抗法对疑似妊娠而拖延取胆汁手术的3例雌黑熊进行了妊娠诊断，结果可对未妊娠个体进行诊断，但是对妊娠黑熊的诊断效果尚不清楚。郑红华等[3]采用人用妊娠诊断盒制剂和MCD-I型检测仪对母熊进行早期妊娠诊断，准确率较高，但是亦对检测时间和固定方法要求较高。金花子等[4]采用放射免疫测定法(RIA)进行了圈养黑熊妊娠诊断初步研究，发现以妊娠着床期血清孕酮含量大于或等于4.38 ng/mL作为雌性黑熊妊娠依据。由于黑熊属于凶猛动物，必须要对其进行麻醉，才能获得血清，但是麻醉药物会对妊娠黑熊胎儿造成影响，这种预测方法不能推广应用。

1993年，郭伟等[5]首次采用定性酶标药盒较准确地测出了大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)交配后尿中PCG，从而确定大熊猫是否受孕。之前，我们已采用酶联免疫技术对圈养黑熊发情周期尿液中雌二醇、孕酮含量变化进行研究，发现雌二醇是启动圈养黑熊繁殖发情的重要因素[6]。为了能对黑熊进行早期妊娠诊断，本试验采用酶联免疫分析法测定圈养黑熊尿液中妊娠中后期孕酮变化情况，以期准确判断配种圈养黑熊妊娠与否。

1 材料

1.1 试验动物

根据雌性黑熊的繁殖特点，选择5～16岁，身体健康，发育健全，繁殖机能正常的雌性黑熊6头，分为试验组和对照组，其中试验组3头为繁殖母熊，编号分别为0204、06、74，3头圈养黑熊均为2016年产过幼仔的繁殖母熊，已参与2016年配种计划；对照组3头为取胆母熊，编号分别为0511、9914、0307，未参与2016年配种计划，但0511、0307分别于上一年度参与配种计划，并于2016年2月产仔，均由四川养麝研究所养熊场提供。

1.2 尿样收集

为排除性激素水平日常波动的干扰，只取早晨新鲜尿液，取样时间从2016年10月13日持续到12月13日，共计取样10次。每周二早晨收集黑熊第1次晨尿10 mL，以3 000 r/min离心15 min，然后取上清液，置-20℃保存待用。

1.3 检测试剂

雌二醇/孕酮酶联免疫法定量试剂盒，购自北京北方生物技术研究所。

1.4 主要仪器

酶标分析仪(工作波长为450 nm)，由安图实验仪器(郑州)有限公司生产，仪器型号为PHOMO.。

2 方法

激素测定采用酶联免疫竞争法测定尿液中雌二醇、孕酮含量[6]。所有的数据均采用平均值±标准差表示，数据间的差异显著性釆用SPSS统计软件的单样本t检验分析得出。利用Excel绘制测定圈养黑熊妊娠期的激素变化趋势图并进行分析比较。

3 结果与分析

3.1 圈养黑熊雌二醇、孕酮含量的分析

通过测定6只圈养黑熊10～12月之间尿液中雌二醇、孕酮含量变化，发现圈养参配母熊的雌二醇的含量基本一致，孕酮的含量呈现一定的规律。在妊娠中后期，3头试验配种母熊、3头对照组取胆母熊雌二醇和孕酮的基本情况见表1。

表1 妊娠期圈养参配黑熊雌二醇和孕酮含量基本情况

Tab.1 The content of estradiol and progesterone in captive black bear

注：同列数据肩标大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无肩标表示差异不显著(P>0.05)

Note：The capital letter with column data showed very significant difference(P<0.01)，no capital letter showed no significant difference(P>0.05)

从表1所列的结果可以看出，6头黑熊的雌二醇含量差异不显著；编号为06、74、9914母熊的孕酮含量在整个测定周期内差异极显著(P<0.01)，呈现2～3个峰值，波动较大，06、74孕酮含量均值高，而9914孕酮含量均值最低。

3.2 0204号繁殖母熊孕酮在妊娠中后期内的动态变化

从图1可以看出，0204号圈养黑熊孕酮检测值在第1次(10月11日)出现最高39.54 ng/mL，随后逐渐下降趋势，但是在第6次采样时(11月15日)，孕酮的值出现升高(17.61 ng/mL)，但随之降低，整个检测期中呈现波浪式变化规律。

图1 0204号繁殖母熊孕酮在妊娠中后期内的变化Fig.1 The changes of progesterone in the number 0204 of femalereproductive bear during the middle and late pregnancy

3.3 06号繁殖母熊孕酮在妊娠中后期内的动态变化

从图2可以看出，06号孕酮变化曲线呈现“山”字形，孕酮第1个波峰的值为17.08 ng/mL，但是孕酮的最高值出现在第6次采样时间段(11月15日)，其值为26.39 ng/mL，在最后12月13日检测值较其他5头母熊高出许多，达23.09 ng/mL。

3.4 74号繁殖母熊孕酮在妊娠中后期内的动态变化

从图3可以看出，74号的孕酮变化呈现一定的规律变化，检测期间孕酮值在较高水平上变化，孕酮共出现3个高值，孕酮的最高含量为31.90 ng/mL，孕酮的最低含量为5.99 ng/mL，远远高于其他5头。

图2 06号繁殖母熊孕酮在妊娠中后期内的变化Fig.2 The changes of progesterone in the number 06 of female reproductive bear during the middle and late pregnancy

图3 74号繁殖母熊孕酮在妊娠中后期内的变化Fig.3 The changes of progesterone in the number 74 of femalereproductive bear during the middle and late pregnancy

3.5 0511号取胆母熊尿液中孕酮的动态变化

从图4可以看出，0511号孕酮值在第3次检测出现峰值(10月25日)28.05 ng/mL随后逐渐降低，在最后一次采样(12月13日)出现最低值。

图4 0511号取胆母熊尿液中孕酮含量的变化Fig.4 The changes of progesterone content in the number 0511 of urine female bear

3.6 0307号取胆母熊尿液中孕酮的动态变化

从图5可以看出，0307号孕酮检测值在第1次(10月11日)出现孕酮的最高含量为32.62 ng/mL，随后逐渐降低，在最后一次采样出现孕酮的最低含量值为1.62 ng/mL。

3.7 9914号取胆母熊尿液中孕酮的动态变化

从图6可以看出，9914号的孕酮值都较低水平上呈波浪式变动，最高值仅为2.73 ng/mL，在最后一次采样时又出现降低，孕酮的最低含量为0.45 ng/mL，为同一个波谷。

图5 0307号取胆母熊尿液中孕酮含量的变化Fig.5 The changes of progesterone content in the number 0307 of urine female bear

图6 9914号取胆母熊尿液中孕酮含量的变化Fig.6 The changes of progesterone content in the number 9914 of female bear urine

3.8 产仔情况统计

试验组的3头黑熊，0204、74、06分别于2017年1月13日、1月13日和2月13日产仔，均为双胎；而对照组的3头黑熊均未产仔。

与孕酮检测值结合分析，发现在11月之后，孕酮测量值高于10 ng/mL的个体，能够产仔；在10月检出的高孕酮含量，不能对圈养黑熊是否产仔起指导作用。

4 讨论

为了对黑熊进行早期妊娠诊断，本试验应用酶联免疫法测定了妊娠期圈养黑熊的雌二醇和孕酮含量。在本试验中，雌二醇含量基本维持在300 pg/mL左右，且变化幅度不大，而前期的试验结果发现发情期雌二醇的峰值含量为1 000 pg/mL左右[6]，对比显示妊娠期雌二醇含量基本维持在较低水平，进一步证实了雌二醇对圈养黑熊繁殖发情非常重要。

对6头黑熊妊娠中后期孕酮含量进行分析，发现0511和0307的孕酮含量在检测初期最高，随后整个下降趋势明显，而9914的孕酮含量一直维持在较低水平，这与黑熊的未妊娠表现相一致。根据资料显示，9914未曾配种产仔，而0511、0307于2016年2月产仔，分析原因可能是年初的产仔事实可能会影响下一个年度的激素表现水平。李春等[7]研究发现，小熊猫(Ailurusfulgens)在交配后的孕酮浓度维持在高水平，而雌二醇浓度维持在低水平。在本试验中，参配黑熊的孕酮含量波动较大，孕酮含量峰值均在20 ng/mL以上，而雌二醇含量较低，这可能是因为高水平的孕酮浓度不仅可使雌性保持性冷淡，有利于胚胎的稳固、减少流产，而且还可维持子宫黏膜增生、刺激子宫腺增长、弯曲增多、分泌加强，有利于维持妊娠[8]。由于黑熊的受精卵有延迟着床现象，只有受精卵着床之后，检测孕酮含量才能对是否妊娠起指导作用。在本试验中，我们发现参配母熊0204、06、74的孕酮在11月15日检测含量最高，均高于10 ng/mL，0204、74的孕酮含量均随之下降，而06的孕酮含量波动较大；未参配的黑熊孕酮含量均在10 ng/mL以下。3头黑熊的产仔结果进一步证实在11月检测到高水平的孕酮含量(高于10 ng/mL)，能够对妊娠结果进行提示。

对3头参配母熊的孕酮变化曲线进行分析，发现0204与06、74曲线变化差异较大，但是基于3头母熊的饲养条件均相同，可排除饲养环境和饲养条件这部分外因。根据配种记录，发现0204的配种产仔时间与74几乎一致，但0204的年龄为14岁，74的年龄为12岁，究竟是何种原因造成这种差异，还有待分析。

上述结论对诊断圈养黑熊妊娠工作提供一定的参考，为圈养黑熊繁育研究提供一定研究数据。但受圈养黑熊数量、年龄、生理状况及试验方法等多种因素的影响，因此试验结果仅供参考，还有待于进一步细化研究方案、扩大数量。

[1] 郑星道，尹云厚，吴延春，等.应用超声多普勒检测仪、妊娠诊断盒对母熊早期怀孕诊断的试验研究[J].黑龙江畜牧兽医，1996(2)：31-33.

[2] 文泓淳，李炳权，李文学，等.用多普勒法和激素对抗法对黑熊进行妊娠诊断[J].黑龙江畜牧兽医，1991(1)：37.

[3] 郑红华，尹云厚，郑星道，等.应用超声检测仪及人用妊娠诊断盒对母熊早期妊娠诊断试验[J].中国兽医杂志，2004，40(2)：21-22.

[4] 金花子，金杰，李继鹏，等.放射免疫测定法(RIA)应用于圈养黑熊妊娠诊断的初探[J].黑龙江畜牧兽医，2014(6)：99-100.

[5] 郭伟，朱本仁.应用定性酶标法测定大熊猫妊娠试验初报[J].四川动物，1993，12(4)：36-37.

[6] 郑程莉，刘太秀，汪晓郓，等.圈养黑熊发情周期尿液雌二醇、孕酮含量变化研究[J].黑龙江畜牧兽医，2016(15)：213-215，219.

[7] 李春，魏辅文，胡锦矗.雌性小熊猫粪样中雌二醇与孕酮水平的变化与繁殖启动的关系[J].动物学研究，2005，26(2)：147-151.

[8] 王建辰，章孝荣.动物生殖调控[M].合肥：安徽科学技术出版社，1998.

Captive black bear；Progesterone；ELISA；Pregnancy

Changes of Progesterone Content in Urine of Captive Black Bears During Middle and Late Pregnancy

Zheng Chengli Liu Taixiu*Zhou Lei Wang Xiaoyun

(Sichuan Institute of Musk Deer Breeding，Chengdu，611845，China)

We measured change in the content of progesterone in the urine of 6 captive female black bears from Sichuan Musk Deer Breeding Institute by Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)for over two months from 11 October to 13 December 2016.In the experimental group(3 breeding females)，the highest content of progesterone was 39.54 ng/mL，the lowest was 2.45 ng/mL.The content of progesterone was above 10 ng/mL in November.In the control group(3 female bile bears)，the highest content of progesterone was 32.62 ng/mL，the minimum value was 0.05 ng/mL，and the progesterone content was below 10 ng/mL during November and December.Progesterone content in the experimental group fluctuated regularly with one or two peak of progesterone.In the control group，there was no change in the progesterone content with the unmated bile bear progesterone and the progesterone value was significantly lower than that of experimental group.The experimental group all successfully reproduced，which indicated the changes of progesterone content in pregnant captive black bear urine can reflect the development of the placenta during pregnancy.This result could guide further study in the use of progesterone content as an index of pregnancy in captive black bears.

2017-03-20

修回日期：2017-04-11

发表日期：2017-11-10

S865.3+1 S814.1

A

2310-1490(2017)04-565-04

四川省应用基础计划项目(15JC0033)

郑程莉，女，31岁，实习研究员，硕士；主要从事动物繁殖研究。E-mail：626771329@qq.com

*通讯作者：刘太秀，E-mail：fexiak@163.com