MMP-2、VEGF在食管癌变过程中的作用研究*

徐志彬，袁丽，郑秀丽，王士杰，吴明利

（河北医科大学第四医院 内镜科，河北 石家庄 050011）

临床研究·论著

MMP-2、VEGF在食管癌变过程中的作用研究*

徐志彬，袁丽，郑秀丽，王士杰，吴明利

（河北医科大学第四医院 内镜科，河北 石家庄 050011）

目的 研究活化的间质成纤维细胞表达的基质金属蛋白酶2（MMP-2）及血管内皮生长因子（VEGF）蛋白在正常食管、食管癌前病变、早期食管癌、进展期食管癌发展过程中的作用。方法 免疫组织化学法检测MMP-2和VEGF蛋白在正常食管20例，低级别上皮内瘤变30例，高级别上皮内瘤变50例，早期癌25癌，进展期癌25例中的表达。抗体CD34标记血管内皮细胞，检测微血管密度。结果 随食管癌变进展，MMP-2 蛋白在食管间质中的表达阳性率依次为 0%（0/20）、0%（0/30）、28%（14/50）、40%（10/25） 和 60%（15/25）。VEGF 蛋白在间质成纤维细胞中的表达阳性率依次为 0%（0/20）、3%（1/30）、26%（13/50）、36%（9/25）和52%（13/25），MMP-2和VEGF蛋白在5组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 随着食管癌变进展，间质成纤维细胞发生活化，分泌表达的MMP-2逐渐增多，从而降解基底膜，促进癌的下侵；过度表达的VEGF蛋白促进间质微血管的形成，加速癌的进展和转移。

癌相关纤维母细胞；基质金属蛋白酶；癌变；癌前病变

癌相关纤维母细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用[1-4]。CAFs的活化状态常为平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）阳性表达，该类细胞的胶原蛋白和透明质酸合成明显增多，分泌能力、增殖能力及侵袭能力发生显著改变。研究表明，在食管癌变进程中，食管间质中的成纤维细胞逐步发生活化，在食管癌阶段即称为食管癌相关纤维母细胞；观察发现食管癌前病变和早期癌阶段的活化间质成纤维细胞可见多种细胞因子和生长因子[5-7]。除食管癌细胞以外，活化的间质成纤维细胞也是基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的重要来源。在食管癌变的多个阶段，间质中活化的间质成纤维细胞分泌的基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和 VEGF 蛋白在食管癌的侵袭和转移中是否会促进病变的血管生成和血运转移，尚需进一步探讨和研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2006年1月-2012年12月河北医科大学第四医院病理组织标本150例，共分为5组：正常食管组织20例，低级别上皮内瘤变组30例，高级别上皮内瘤变组50例，早期癌组25例，进展期癌组25例。本研究经过本院伦理委员会审批通过。

1.2 α-SMA、MMP-2和VEGF蛋白检测

采用免疫组织化学一步法，用已知阳性的人癌组织切片作阳性对照组，以磷酸盐缓冲溶液代替一抗作阴性对照。α-SMA鼠抗人单克隆抗体和CD34鼠抗人单克隆抗体由北京西雅金桥生物技术有限公司提供，MMP-2兔多抗免疫球蛋白G、VEGF兔多克隆抗体由美国bioworld公司提供，工作浓度1∶100。

判断标准：按照王立峰等[8]的标准，以间质成纤维细胞胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，观察5个具有代表性的高倍镜视野（×400），无明显阳性细胞为（-），局灶阳性为（+），弥漫阳性为（++），为便于统计，将（+）、（++）合并为阳性。上皮细胞质及细胞膜中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。在染色均匀的区域，选取5个高倍镜视野（×400），根据阳性细胞所占百分比，＜1/3为阴性表达，≥1/3为阳性表达。

1.3 食管癌变过程中微血管密度的测算

参照MAEDA等[9]的方法，先在100倍镜视野下观察CD34阳性染色的微血管高密度区，即热点区。在400倍镜视野下观察，凡与周围细胞和结缔组织成份有明显区别的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个微血管；管腔直径＞8个红细胞或肌层较厚的血管均不计数。记录3个高倍镜视野下的微血管数值，取平均值作为每例食管癌变过程中的微血管密度（microvessel density，MVD）值。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用方差分析，组间两两比较用LSD-t检验；计数资料以率或百分比表示，用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

正常食管组织组20例，男性9例，平均年龄（58.0±2.1）岁；女性 11例，平均年龄（62.0±3.3）岁。低级别上皮内瘤变组30例，男性20例，平均年龄（58.0±1.5）岁；女性 10例，平均年龄（63.0±1.8）岁。高级别上皮内瘤变组50例，男性29例，平均年龄（57.0±1.1）岁；女性 21例，平均年龄（60.0±5.3）岁。早期癌组25例，男性13例，平均年龄（60.0±2.3）岁；女性12例，平均年龄（63.0±2.6）岁。进展期癌组25例，男性13例，平均年龄（60.0±3.1）岁；女性12例，平均年龄（62.0±4.5）岁。各组性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；各组年龄呈正态分布，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 α-SMA在食管癌变过程中的表达

α-SMA阳性间质成纤维细胞呈梭形或条带样，主要存在于癌前病变或癌巢周围间质中，在进展期癌时密集呈条索状包裹着癌巢。α-SMA在正常食管组织成纤维细胞基本无表达（0/20），低级别上皮内瘤变组表达率为10%（3/30），高级别上皮内瘤变组表达率为36%（18/50），早期癌组表达率为60%（15/25），进展期癌组的表达率为92%（23/25），α-SMA表达阳性率组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。低级别上皮内瘤变组与正常食管组织组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；高级别上皮内瘤变组、早期癌组及进展期癌组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1和图1。

2.3 MMP-2蛋白在食管癌变过程中的表达

MMP-2蛋白表达主要定位于不典型增生上皮细胞、癌细胞、癌旁纤维母细胞及癌前病变间质中的成纤维细胞，胞质着色。MMP-2在正常食管上皮、低级别上皮内瘤变上皮不表达，在高级别上皮内瘤变组、早期癌组、进展期癌组上皮的表达率分别为28%（14/50）、40%（10/25）及 60%（15/25）。低级别上皮内瘤变组与正常食管组织组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；高级别上皮内瘤变组、早期癌组及进展期癌组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1和图2。

表1 临床病理特征与α-SMA、MMP-2及VEGF蛋白的关系 例（%）

图1 α-SMA在食管不同病变阶段间质成纤维细胞中的表达 （免疫组织化学法×200）

图2 MMP-2蛋白在食管不同病变阶段间质成纤维细胞中的表达 （免疫组织化学法×200）

2.4 VEGF在食管癌变过程中的表达

VEGF蛋白表达主要定位于食管不典型增生上皮细胞、食管癌细胞、食管癌相关纤维母细胞及食管癌前病变间质中的成纤维细胞。正常食管鳞状上皮细胞不表达，低级别上皮内瘤变组表达率为3%（1/30），高级别上皮内瘤变组表达率为26%（13/50），早期癌组表达率为36%（9/25），进展期癌组的表达率为52%（13/25）。低级别上皮内瘤变组与正常食管组织组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；高级别上皮内瘤变组、早期癌组及进展期癌组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1和图3。

图3 VEGF在食管不同病变阶段间质成纤维细胞中的表达 （免疫组织化学法×200）

2.5 MVD

正常食管和低级别上皮内瘤变黏膜下间质中血管稀疏，形态规则，而进展期癌血管数目明显增多，管腔直径大小不一，分布无序、杂乱，呈攀状。正常食管组织组MVD值为（12.3±1.6）；低级别上皮内瘤变组为（15.7±2.0）；高级别上皮内瘤变组为（20.9±2.2）；早期癌组为（26.4±2.0）；进展期癌组为（30.0±2.3），组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 临床病理特征与MVD的关系

2.6 α-SMA、VEGF蛋白与MVD的关系

α-SMA阴性组的MVD值与α-SMA阳性组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；VEGF阴性组的MVD值与VEGF阳性组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

3 讨论

食管癌的发生、发展是一个多基因参与、多步骤的缓慢过程，上皮细胞的恶变起主导作用，活化的间质成纤维细胞能分泌多种细胞因子，其中MMPs在食管癌的侵袭和转移过程中发挥重要作用。研究发现，MMPs的来源不仅限于癌细胞，癌间质中大量出现的α-SMA阳性的纤维母细胞也是MMPs的重要来源[10-11]。MMPs与肿瘤的浸润、转移密切相关，其中MMP-2与肿瘤的侵袭和转移过程密切相关[12-14]。MMP-2属于MMPs中的明胶酶，底物为基底膜上变性的胶原蛋白、明胶、Ⅳ型胶原蛋白，不仅能降解基底膜糖蛋白及ECM成分，而且在肿瘤的新生血管形成中起着非常重要的作用。李书军等[15]研究发现，MMP-2主要在食管癌细胞浆内或包膜表达，正常组织中无表达，癌组织及转移灶中表达活性显著增强。DAVIES等[16]研究发现，MMP-2的过表达与乳腺癌的组织学分级及侵袭能力有关，MMP-2通过降解细胞外基质而破坏基底膜，使肿瘤细胞更易于浸润淋巴管。本研究发现，在正常食管组织和低级别上皮内瘤变中，食管间质成纤维细胞的α-SMA表达阴性或阳性率低，间质成纤维细胞未发生活化或活化率低，MMP-2基本不表达或表达很弱，而在高级别上皮内瘤变和癌组织中，伴随着间质成纤维细胞的α-SMA表达阳性而大量活化，其表达MMP-2的能力也增强，尤其是在进展期癌间质组织中。提示在早期癌阶段甚至是癌前病变阶段，上皮细胞和间质成纤维细胞中MMP-2即开始逐渐蓄积，为肿瘤的侵袭转移做好准备。

有学者将癌相关母细胞、内皮细胞与癌细胞体外共同培养，发现内皮细胞和癌相关纤维母细胞都向肿瘤团块内浸润性生长[17]。这表明癌相关纤维母细胞可促进肿瘤血管的形成。实验报道，癌相关纤维母细胞促进微血管增生的能力比正常纤维母细胞高4.7倍，其聚集血管内皮细胞的能力是正常纤维母细胞的4.2倍[18]。研究证实，在多种肿瘤组织中，活化的间质成纤维细胞可分泌多种生长因子和化学因子，如趋化因子、MMP-13、肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）等，其通过各自的传导通路，交互或直接刺激VEGF蛋白的过表达，直接或间接刺激肿瘤血管生成[19-21]。本研究发现，在食管癌变进程中，随着α-SMA蛋白的阳性表达，间质成纤维细胞逐步活化，VEGF蛋白的表达阳性率逐渐增高，微血管密度逐渐升高。

以往肿瘤的治疗都是以癌细胞为靶目标，肿瘤微环境的提出打破传统的治疗理念，针对间质成纤维细胞开发的药物，如HGF/c-Met signaling抑制剂SU11274、抗-HGF单克隆抗体NK4等，在人体和动物抑制肿瘤浸润、转移中也取得初步成效。开发能够抑制和阻断MMP-2、VEGF的抑制剂，并联合其他靶点进行抗肿瘤治疗，也许能为治愈食管癌带来新的希望。

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Roles of MMP-2 and VEGF expressions in activated stromal fibroblasts during esophageal carcinogenesis*

Zhi-bin Xu,Li Yuan,Xiu-li Zheng,Shi-jie Wang,Ming-li Wu
(Department of Endoscopy,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei 050011,China)

Objective To investigate the expressions of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2)and vascular endothelial growth factor(VEGF)proteins in the stromal fibroblasts in different esophageal lesions from normal tissue,precancerous lesion,to early carcinoma(CIS)and advanced carcinoma(EA).Methods IHC method was uesd to detect the expression of MMP-2 protein and VEGF protein in the stromal fibroblasts and epithelia in different lesions in esophageal carcinogenesis,including normal group (20 cases),low-grade intraepithelial neoplasia(LGIEN)group(30 cases),HGIEN group(50 cases),CIS group(25 cases)and EA group(25 cases)respectively.Antibody CD34 was used to label vascular endothelial cells for microvascular density detection.Results In the esophageal stromal fibroblasts of the normal,LGIEN,HGIEN,CIS and EA groups,the positive-expression rates of MMP-2 protein were 0%(0/20),0%(0/30),28%(14/50),40%(10/25)and 60%(15/25)respectively;and the positive-expression rates of VEGF protein were 0.0%(0/20),3.3%(1/30),26.0%(13/50),36.0% (9/25)and 52.0% (13/25)respectively.The positive expression rates of each protein had significant differences among the five groups (P＜0.05).Conclusions With esophageal cancer progression,the interstitial fibroblasts are activated,the secretion of MMP-2 protrein increases,resulting in degradation of the basement membrane and promotion of cancer invasion.Excessive expression of VEGF protein promotes the formation of interstitial capillaries,accelerates cancer progression and metastasis.

cancer-associated fibroblast;matrix metalloproteinase;carcinogenesis;precancerous lesion

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.008

1005-8982（2017）26-0040-05

2016-09-02

河北省卫生厅2015年度医学科学研究重点课题计划项目（No：20150749）[

吴明利，E-mail：wu.ml@tom.com；Tel：13933083646

（童颖丹 编辑）